Ablation par laser à deux photons d’ostéoblastes chez des larves de poisson-zèbre en développement

Résumé

Ce protocole décrit une approche d’ablation laser à deux photons réalisée chez des larves de poisson-zèbre, qui sert de modèle pour étudier la régénération osseuse et les effets de la réponse immunitaire à l’ablation.

Résumé

Le poisson-zèbre (Danio rerio) a une capacité exceptionnelle à régénérer différents organes et appendices. La régénération osseuse chez le poisson-zèbre a été étudiée à l’aide de différentes méthodes telles que l’amputation des nageoires, l’épilation des écailles, la trépanation du crâne et les approches microscopiques. À l’aide d’une configuration de balayage laser confocal équipée d’un laser à deux photons, une méthode d’ablation laser a été développée comme paradigme de lésion pour ablater les cellules formant l’os (ostéoblastes) dans l’opercule en développement des larves de poisson-zèbre. La méthode décrite ici permet l’ablation des cellules de manière précise, car la surface, la forme et la profondeur peuvent être ajustées avec précision. De plus, cette méthode permet d’imager la zone avant et juste après l’ablation, de sorte que les effets à court terme de la blessure peuvent être analysés. Dans ce dispositif expérimental, la réponse immunitaire après ablation des ostéoblastes dans la zone lésée a été étudiée. Une augmentation du recrutement des macrophages a été observée après l’ablation, indiquant la pertinence de leur présence lors de la régénération osseuse.

Introduction

Le poisson-zèbre régénère divers organes tels que la rétine, le cerveau, le cœur et le pancréas¹. De plus, le poisson-zèbre régénère les éléments squelettiques, c’est pourquoi il a été utilisé pour étudier la régénération des nageoires, des écailles et des calvaires (calottes crâniennes)². Différents paradigmes expérimentaux ont été utilisés pour étudier la régénération tissulaire et osseuse, tels que la résection de la nageoire (amputation), la fracture de la nageoire, la trépanation du crâne ^3,4, la cryolésion ^5,6

Protocole

Le protocole d’étude a reçu l’approbation de la Landesdirektion Sachsen, numéros de permis 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Les souches de poisson-zèbre utilisées ont été maintenues conformément à la législation nationale et dans des conditions normalisées comme décrit précédemment^27,28. Les détails de tous les réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation des matériaux et des solutions

1. Conservez les embryon....

Discussion

L’ablation au laser a été appliquée dans diverses disciplines de la recherche biologique. En particulier, il a été utile comme méthode pour étudier la régénération tissulaire 10,11,12. Par exemple, le recrutement et les changements phénotypiques des cellules immunitaires innées ont récemment été analysés au fil du temps à l’aide d’un laser UV ou de tests d’ablation laser.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride dihydrate, CaCl2·H2O	Carl Roth	5239.1
Cell Culture Dish, PS, 100/20 mm	Greiner Bio-one	664160
Dumont #55 Foceps	FST	11295-51	Tip shape straight, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm
Falcon 6-well plate	Corning	353502
Glass-bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm Glass Diameter, Uncoated
Insight X3 multiphoton laser	Spectra-Physics
Leica Application Suite	LAS X, Leica Microsystems
Low melting agarose	Biozyme	840101	Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M5921
Mating cages			many varieties, e.g. Tecniplast
Methyleneblue	Carl Roth	A514.1
MS-222	SIGMA Aldrich	A5040
Potassium Chloride, KCl	PanReac AppliChem	131494
Sodium chloride, NaCl	Carl Roth	3957.1
SP8 FALCON	Leica Microsystems		Equipped with a Insight X3 multiphoton laser and Leica Application Suite software
Stainless Steel Dissect Needle	Bochem	12010	140 mm
Stereo Microscope System SZX16	Olympus		Equipped with a LED illumination base SZX2-ILLTQ
Thermostatic Cabinets TS - WTW	xylem	TS 608/2-i	For incubation (embryo)
Transfer pipette, 3.5 mL	SARSTEDT	861171	155 x 15 mm, LD-PE, transparent
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0.	Zeiss		Equipped with Axiocam MRm camera and AxioVision sofware