Isolement enzymatique des vésicules extracellulaires interstitielles du muscle squelettique

Résumé

Ce protocole vise à isoler et à purifier les vésicules extracellulaires interstitielles des muscles squelettiques (SkM-EV) des tissus musculaires des rongeurs par détachement mécanique, dissociation enzymatique, filtration et ultracentrifugation différentielle. Il fait preuve de cohérence et de fiabilité. Les SkM-EV isolés fournissent des informations sur l’homéostasie musculaire et les maladies, avec des applications potentielles en tant que biomarqueurs diagnostiques ou véhicules thérapeutiques.

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanoparticules enfermées dans des lipides bicouches libérées par les cellules pour transporter des marchandises bioactives, telles que des protéines, des ARN et des ADN, pour la communication intercellulaire. L’étude de la diaphonie médiée par l’EV entre les cellules de l’homéostasie musculaire et des maladies offre un potentiel important pour améliorer notre compréhension du développement, de la régénération et de l’atrophie musculaires. Cependant, les protocoles actuels d’isolement des VE dérivés des muscles squelettiques (SkM-EV) rencontrent des défis pour atteindre une pureté et un rendement élevés, principalement en raison des difficultés à libérer les VE des tissus musculaires sans compromettre les membranes cellulaires. Cet article présente un protocole efficace pour l’isolement SkM-EV, comprenant le détachement mécanique, la dissociation enzymatique, la filtration et l’ultracentrifugation. Ces étapes sont optimisées pour améliorer la libération des VE par les tissus musculaires, ce qui permet d’obtenir des SkM-EV de haute pureté. Par la suite, la cytométrie en nanoflux, le dosage des BCA et le test Western blot sont effectués pour caractériser la quantité et la qualité des SkM-EV isolés. Ce protocole est prometteur pour l’établissement d’une plate-forme fiable permettant d’obtenir des VE dérivées de tissus pour faire progresser la recherche fondamentale, le diagnostic des maladies et l’administration de médicaments.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules de taille nanométrique, liées à une membrane, libérées par les cellules dans l’environnement extracellulaire. Ces VE transfèrent des acides nucléiques, des protéines et des lipides pour moduler plusieurs voies de signalisation lors de l’absorption par les cellules réceptrices. Plus précisément, les VE isolés du muscle squelettique (SkM-EV) ont été impliqués dans la dégénérescence, la régénération et la croissance musculaires en transférant des microARN régulateurs myogéniques ou des facteurs de transcription 1,2,3,4.^....

Protocole

Ce protocole isole les vésicules extracellulaires (VE) du tissu musculaire squelettique à l’aide du détachement mécanique, de la dissociation enzymatique, de la filtration et de l’ultracentrifugation différentielle. Il permet d’isoler les VE à partir de groupes musculaires individuels ou combinés de rongeurs, notamment le tibial antérieur (TA), l’extenseur des doigts longs (EDL), le soléaire (SOL), le gastrocnémien (GAS) et le quadriceps (QUA). L’utilisation des animaux a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Géorgie, et l’étude a été conforme aux directives des Nation....

Résultats

À la suite de ce protocole, des vésicules extracellulaires musculaires squelettiques (SkM-EV) ont été extraites avec succès de divers groupes musculaires, notamment le tibial antérieur (TA), le long extenseur des doigts (EDL), le soléaire (SOL), le gastrocnémien (GAS) et le quadriceps (QUA) de souris de type sauvage. La caractérisation ultérieure de ces SkM-EV a été réalisée par cytométrie en nanoflux, élucidant leurs caractéristiques distinctes telles que résumées dan.......

Discussion

Le protocole commence par la dissection de groupes musculaires des membres postérieurs de souris ou l’acquisition de tissus musculaires humains post-mortem sur la base des protocoles disponibles¹⁶. Les procédures d’isolement des vésicules extracellulaires des muscles squelettiques (SkM-EV) suivantes comprennent trois sections principales : digestion enzymatique légère du tissu pour libérer les SkM-EV interstitiels, filtration et centrifugation à basse v.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL microcentrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	05-408-120
1.5 mL micro tube (C)	Eppendorf	5720411009
1.5 mL microcentrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	3448	Clear, graduated, nonsterile
BD 5 mL Syringe	Becton Dickinson	14-827-52	luer-lok tip
Cell Counting Slides, Dual Chamber for Cell Counter	Bio-Rad	145-0011
Centrifuge 5430R	Eppendorf	22620667
Cleaning solution	NanoFCM Inc.
Collagenase II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
DPBS (10x) Liquid (-calcium,-magnesium)	Cytiva	SH30378.02	Final used dilution is 1x
DPBS/Modified (1x)	Cytiva	SH30264.02
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Genesee Scientific	25-500
E-POD Pure Water Remote Dispenser	Millipore Sigma	ZRXSP0D01
FA-45-30-11 Microcentrifuge Rotor	Eppendorf	05-401-503
Fisher Vortex Genie 2	ThermoFisher Scientific	12-812
Flow NanoAnalyzer	NanoFCM Inc.
Heratherm OGS60 General Protocol Oven	ThermoFisher Scientific	51028112	Gravity convection, 2.3 cu.ft. 120 V
MemGlow-488 Probe	Cytoskeleton Inc.	MG01-02
Millipak Special Millipore	Millipore Sigma	TANKMPK02
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Rainin	17014392
Pipette tips ER LTS 1000µL F 768G/8	Rainin	30808038
Pipette tips ER LTS 20µL F 960G/10	Rainin	30807966
Pipette tips ER LTS 200µL F 960G/10	Rainin	30807967
Quality Control beads	NanoFCM Inc.
S110-AT Fixed Angle Rotor	ThermoFisher Scientific	45539	1,10,000 rpm
S16 exo 65-155nm beads	NanoFCM Inc.
Scissors	SPI, USA
Sorvall mX 150+ Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher Scientific	50135641
TC 20 automated cell counter	Bio-Rad	1450102
Trypan Blue Solution	Corning	25-900-CI
Tweezers	SPI, USA
VWR 15mL centrifuge tubes	Avantor	89039-668
Whatman Puradisc 13 Filters	Cytiva	6782-1304	0.45 µm pore size
Wild-type C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	stock #000664