Quantification de la migration cellulaire tridimensionnelle à l’intérieur et dans les biomatériaux d’hydrogel granulaire

Résumé

Un protocole pour l’évaluation quantitative de la migration cellulaire 3D à l’intérieur et dans l’interface des hydrogels granulaires est présenté ici.

Résumé

Les échafaudages d’hydrogel granulaire présentent un potentiel important en médecine régénérative, fonctionnant soit comme des supports pour l’administration de cellules, soit comme des interfaces pour l’intégration tissulaire. Cet article présente deux nouvelles approches pour quantifier la migration cellulaire à l’intérieur et dans les hydrogels granulaires, en mettant en évidence les applications distinctes de ces échafaudages. Tout d’abord, un test d’interface cellulaire monocouche qui simule la croissance tissulaire dans des hydrogels granulaires à des fins d’intégration est présenté. Deuxièmement, un test à base de sphéroïdes est décrit, conçu pour suivre le mouvement cellulaire dans la matrice d’hydrogel, spécifiquement adapté aux applications impliquant l’administration de cellules. Les deux méthodes permettent des mesures précises et contrôlées de la migration cellulaire, fournissant une boîte à outils complète pour les chercheurs utilisant des échafaudages d’hydrogel granulaire. La motivation de ces méthodes découle de la nécessité d’un contrôle personnalisé de la migration cellulaire à l’intérieur de l’échafaudage pour s’aligner sur des applications spécifiques. En optimisant et en normalisant ces techniques de quantification, les chercheurs peuvent affiner de manière itérative les propriétés de l’hydrogel granulaire, garantissant ainsi leur efficacité dans divers contextes de médecine régénérative. Cet ensemble robuste d’outils quantitatifs offre de nouvelles possibilités d’améliorer les échafaudages d’hydrogel granulaires, faisant progresser leur utilisation dans les applications d’administration cellulaire et d’intégration tissulaire.

Introduction

Les biomatériaux pour des applications thérapeutiques évoluent de plus en plus vers des modèles plus complexes et pertinents d’environnements cellulaires pour étudier l’intégration tissulaire. Les échafaudages en biomatériaux fournissent une structure tridimensionnelle (3D) pour la croissance cellulaire et visent à imiter un tissu souhaité ^1,2. Les modèles de culture cellulaire tridimensionnelle comprennent des matrices naturelles et des échafaudages synthétiques qui fournissent aux cellules une complexité supplémentaire via des signaux haptotactiques ou chimiotactiques ^3,4. Les échafaudages traditionnels en hydrogel sont réticulés en vrac, ce qui donne un maillage nanoporeux qui permet la diffusion de petites molécules ^5,6, mais nécessite une dégradation pour la migration à l’échelle cellulaire dans une zone tissulaire nécessitant une réparation⁷. Les hydrogels granulaires sont un sous-ensemble de biomatériaux qui ont un fort potentiel d’application clinique en raison de leur biocompatibilité, de leur capacité à s’adapter à des formes irrégulières et, dans de nombreux cas, de leur^{injectabilité8,9}. Leur nature modulaire offre l’avantage de la porosité à l’échelle cellulaire pour améliorer l’infiltration tissulaire et l’angiogenèse ainsi que de la modularité, qui permet l’ajout de signaux hétérogènes pour le comportement cellulaire 10,11,12. La compréhension de la réponse cellulaire et du mouvement au sein d’un échafaudage 3D est essentielle pour la pertinence physiologique dans toutes les applications utilisant des biomatériaux pour l’intégration tissulaire.

Cependant, l’étude de la croissance tissulaire en trois dimensions s’est avérée difficile à réaliser avec une précision quantitative. La complexité accrue d’un environnement 3D nécessite des modèles in vitro de migration cellulaire qui peuvent non seulement fournir des informations sur le comportement cellulaire, mais aussi optimiser l’état des matériaux. Des rapports précédemment publiés sur la migration cellulaire d’échafaudage granulaire 3D ont utilisé l’ensemencement topique pour explorer le comportement cellulaire, signalant l’infiltration dans la structure poreuse et la morphologie cellulaire¹³ et d’autres sphéroïdes^14,15, mesurant la longueur de la croissance et le nombre de germes. Les longueurs de migration des semis topiques peuvent être influencées de manière inégale par les forces de gravité et, en raison des limites de la microscopie, les résultats ne peuvent pas être longitudinaux. La méthode de germination des sphéroïdes a été limitée à la quantification 2D par projection maximale, qui est incapable de capturer le mécanisme d’invasion contrôlée. Les deux méthodes sont mesurées dans un plan xy, qui n’a pas la nuance nécessaire pour récapituler pleinement le mouvement cellulaire 3D et l’infiltration de l’échafaudage.

Ce protocole décrit deux approches pour quantifier la migration cellulaire, telles que l’infiltration in vitro dans les échafaudages poreux d’hydrogel granulaire 3D, en utilisant spécifiquement des échafaudages de particules recuites microporeuses (MAP) 16,17,18,19. Le but des méthodes suivantes est d’étudier le comportement cellulaire dans des gels granulaires en contrôlant la directionnalité de leur migration pour une analyse tridimensionnelle. La première, l’approche MAMA (Owner-based Ascending Migration Assay), est un modèle simplifié d’intégration cellulaire endogène qui illustre les interactions cellulaires-matériaux uniformes et sert de plate-forme pour représenter l’environnement initial dans lequel les cellules interagissent avec les hydrogels granulaires ainsi que pour isoler le comportement individuel avant l’infiltration de l’échafaudage. La seconde, appelée méthode PLOSMA (Parallel Layered Outward Migration Migration Test), est un test de migration de sphéroïdes cellulaires en 3D, qui explore le mouvement cellulaire lorsqu’elle est entièrement entourée d’un environnement d’échafaudage complexe et modélise le mouvement cellulaire après l’administration, ainsi que le mouvement après que les cellules sont complètement entrées dans un gel granulaire.

Les deux méthodes sont quantifiables par l’analyse d’images 3D et peuvent être appliquées à l’étude et à l’optimisation des interactions matériau-cellule à l’aide de points temporels longitudinaux pour les applications de médecine régénérative et d’ingénierie tissulaire, où la promotion ou la restriction du mouvement cellulaire fait partie des critères de conception. De plus, ces méthodes tirent parti de la centrifugation sur plaque pour une préparation uniforme des tests multipuits.

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation d’hydrogel granulaire

REMARQUE : Les particules de MAP utilisées dans le cadre de ce protocole sont des particules de gel à 3,2 % p/v avec 45,88 mg/mL DE PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg/mL de RGD, 8,06 mg/mL de MethMal¹⁹ et 5,62 mg/mL de réticulant dégradable MMP-2. La rigidité mécanique du gel est de 15 à 20 kPa pour correspondre à la rigidité cutanée¹⁷.

1. Générez des particules d’hydrogel granulaires et préparez-vous normalement pour la culture cellulaire.
   REMARQUE : Ce protocole décrit la préparation stérile du gel de particules recuites microporeuses, dont la production est détaillée par Roosa et ^al.18.
2. Préparez les particules d’hydrogel granulaires pour une utilisation in vitro en les stérilisant avec trois lavages d’alcool isopropylique à 70 % suivis de trois lavages de 1x PBS stérile.
3. Préparez une solution de phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate de lithium stérile de 0,2 mM dans une solution de milieu en dissolvant la poudre de LAP dans de l’eau ultrapure et en faisant passer la solution à travers un filtre stérile de 0,22 μm. Ajoutez cette solution 1:1 v/v avec la quantité de gel nécessaire pour réaliser l’expérience.
4. Incuber la solution de LAP de 0,2 mM, de gel et de média à 37 °C sur un rotateur de tube à 20 tr/min pendant au moins 30 min avant de procéder pour permettre la diffusion du LAP dans les microparticules.
5. Une fois que 30 minutes se sont écoulées, centrifuger la suspension de particules à 18 000 x g pendant 5 min à 25 °C. Aspirez le surnageant.
   REMARQUE : La siccité globale des particules de MAP peut varier en raison de différences de chimie, d’hydrophilie et de taille des particules. Pour plus de cohérence, il est recommandé de centrifuger la suspension de particules comme décrit, de mélanger les particules dans le tube à l’aide d’une pipette à déplacement positif, puis de répéter l’étape de centrifugation.

2. Méthode MAMA (Singlelayer-based Ascending Migration Assay) : culture cellulaire et imagerie

REMARQUE : Les cellules ont été imagées à l’aide du canal FITC (488 nm). Le colorant utilisé pour les cellules avait une excitation à 492 nm et une émission à 517 nm. Le grossissement 10x offre plus de détails que le grossissement 4x, mais l’un ou l’autre peut être utilisé.

1. Décongeler les fibroblastes dermiques humains (HDF) selon le protocole du fabricant. Passage au besoin jusqu’à ce que le passage souhaité soit atteint ; généralement, les cellules primaires maintiennent leur composition génétique et phénotypique grâce à P5.
2. Plaquez 120 000 cellules/cm² pour au moins n = 6 dans une plaque à 96 puits ou la taille de plaque souhaitée en utilisant le volume de média recommandé par puits pour la suspension, en aspirant doucement avant chaque ajout. Laissez les cellules se fixer pendant la nuit, comme le montre la figure 1A, ce qui entraînera une confluence d’environ 80 % le lendemain.
   REMARQUE : En général, la colonne centrale et les puits de rangée sont les meilleurs pour un étalement optimal du gel. Les auteurs utilisent jusqu’à 24 puits pour une plaque de 96 puits (rangées B-G et colonnes 5-8).
3. Préparez les conditions de gel comme indiqué ci-dessus et, pendant l’incubation dans le LAP, retirez le milieu avec un aspirateur ou une pipette de la plaque de puits des cellules. Attention à ne pas déranger le fond de l’assiette.
4. Ajoutez le colorant de suivi cellulaire dans les puits conformément aux instructions du fabricant, illustrées à la figure 1B. Assurez-vous que le gel est complètement préparé comme décrit à l’étape 1 avant d’aspirer le colorant de suivi cellulaire des puits.
5. Ajouter 20 μL de chaque état de gel dans les puits à l’aide d’une pipette à déplacement positif sans toucher le bas de la plaque.
   REMARQUE : Les meilleures conditions de dosage se produisent lorsque le gel est pipeté directement au centre du puits.
6. À l’aide d’un rotor à plaques à 25 °C, tournez à 100 x g pendant 15 s avec une accélération et une décélération de 8 pour aplatir le gel. Retournez la plaque à 180° et tournez-la à nouveau à 100 x g pendant 15 s pour assurer une répartition uniforme du gel au fond du puits, comme le montre la figure 1C.
7. De manière aseptique, photo-réticuler le gel par le haut (figure 1D) en appliquant une lumière focalisée (365 nm, 34,4 mW/cm²) sur l’échantillon pendant 30 s pour recuire l’échafaudage, en ajoutant 200 μL de milieu à chaque puits de cellules une fois que tous les échafaudages sont formés. Laissez les cellules incuber à 37 °C pendant 30 minutes pour leur permettre de se fixer à l’échafaudage granulaire avant l’imagerie.
8. Pour capturer le comportement de migration résumé dans la figure 1E, imagez les cellules à l’aide d’un microscope confocal. Trouvez le point de focalisation le plus bas pour une zone de la plaque où les cellules sont confluentes à au moins 80 % et définissez-le comme bord inférieur de la pile z.
   1. Trouvez le point le plus élevé du signal fluorescent de la cellule et définissez-le comme bord supérieur de la pile z. Utilisez une taille de pas de 5 μm ou moins pour une meilleure résolution.
9. Imagez au moins trois puits pour représenter la monocouche cellulaire et les hauteurs des cellules non migrantes. Le point temporel t = 0 est illustré à la fois par la vue de dessus et la vue latérale de la figure 2A. Incuber toute la nuit une fois l’imagerie terminée.
   REMARQUE : Ces cellules ont été imagées avec un objectif 4x, et l’exposition a été maintenue constante pour tous les puits.
10. À t = 24 h, les cellules commenceront à monter à travers l’échafaudage granulaire, comme le montre la figure 2B depuis les vues de dessus et de côté. Répéter les étapes d’imagerie comme effectuées pendant t = 0 h en utilisant les mêmes paramètres. Utilisez la hauteur précédente de la scène comme référence ou recherchez les cellules qui n’ont pas encore migré et définissez-la comme bord inférieur de la pile z.
11. Répétez les étapes pour tous les puits, en vous assurant que chaque puits est enregistré sous forme d’image distincte pour faciliter l’analyse.
    REMARQUE : Les points temporels peuvent être imagés pour des points temporels plus longs en fonction des contraintes expérimentales et de la méthode de suivi de la fluorescence cellulaire.
12. Les échafaudages peuvent être fixés et colorés pour des mesures supplémentaires. Au point final souhaité, aspirez le milieu des puits à l’aide d’une pipette et jetez-le. Lavez délicatement chaque puits avec 200 μL de PBS stérile deux fois pendant 5 min chacun. Ajouter 200 μL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 20 min, puis aspirer et jeter. Les puits peuvent être teints immédiatement ou stockés à 4 °C dans 1x PBS pendant une semaine maximum.

3. Méthode MAMA (Singlelayer-based Ascending Migration Assay) : analyse d’images 3D

1. Pour les conversions par lots, ouvrez le logiciel de conversion d’images IMARIS. Faites glisser et déposez les images de microscopie dans le logiciel de conversion et choisissez un dossier à importer dans le logiciel Arena. Appuyez sur Démarrer tout. Les images converties apparaîtront dans l’Arena sous forme de fichiers .ims.
   REMARQUE : Si la taille du voxel n’est pas incluse dans les métadonnées de l’image, reportez-vous aux spécifications d’imagerie confocale individuelles pour trouver la valeur. Alternativement, la taille du voxel peut être estimée à la taille du pas utilisé lors de l’imagerie.
2. Ouvrez le logiciel en double-cliquant sur l’icône IMARIS Arena du bureau et en sélectionnant une image dans l’Arena.
3. L’image est automatiquement chargée dans l’onglet d’analyse 'Vue 3D' qui se trouve dans le panneau d’icônes de la barre d’outils en haut. Cliquez sur l’onglet Image Proc dans la barre d’outils principale.
4. En haut à gauche du panneau latéral, cliquez sur le menu déroulant du canal 1 et sélectionnez Soustraction d’arrière-plan. Appuyez sur Ok en bas du panneau pour revenir à la « Vue 3D ». Les images représentatives de t = 0 h et t = 24 h se trouvent respectivement dans les figures 2A et B.
5. Dans la petite barre d’outils juste au-dessus du menu du panneau latéral, cliquez sur l’icône aux formes bleues arrondies, Ajouter de nouvelles surfaces, pour créer un onglet d’objets modifiables nommé « Surfaces 1 ».
6. Une interface pour la création des paramètres de l’algorithme s’ouvrira vers le bas du panneau de menu. Générez manuellement les paramètres à utiliser pour toutes les réplications en cliquant sur le bouton flèche bleue en bas de l’interface. Assurez-vous que le bon canal source est sélectionné et cochez la case « Lisse ».
   1. Réglez les détails de la surface sur 0,7 μm et sélectionnez Soustraction d’arrière-plan (contraste local). Tapez la longueur moyenne de la cellule dans la zone « Diamètre de la plus grande sphère qui tient dans l’objet ». Appuyez sur la même flèche bleue en bas lorsque vous avez terminé.
      REMARQUE : Cette valeur peut être estimée à l’aide de l’onglet « Tranche » de la barre d’outils et en mesurant la largeur des cellules moyennes.
7. Pour le seuillage, déterminez l’histogramme d’intensité où seules les cellules les plus brillantes sont segmentées. À l’aide du segmenteur, déplacez-vous vers le haut et vers le bas dans la pile d’images pour vous assurer qu’elle est aussi précise que possible.
   1. Sélectionnez Activer pour « Diviser les objets en contact (croissance de la région) » et définissez le diamètre des points d’amorçage sur le même diamètre que celui utilisé précédemment. Assurez-vous que l’option « Basé sur l’intensité » est sélectionnée et cliquez sur le bouton flèche bleue vers la droite.
8. Les deux étapes suivantes, Points d’amorçage du filtre et Surfaces du filtre, peuvent être ajustées par plusieurs mesures pour s’assurer que les surfaces générées sont exactes ; Cependant, l’analyse de base ne nécessite aucun filtrage supplémentaire. Lorsqu’aucune modification n’est nécessaire, cliquez sur le bouton de la flèche bleue .
   REMARQUE : La dernière étape permet une classification plus poussée de la surface en fonction de la sortie souhaitée. Une fois les modifications effectuées, cliquez sur le bouton fléché vert pour terminer la création des surfaces.
9. Pour enregistrer les paramètres de création pour l’analyse par lots, cliquez sur l’icône de baguette Création. Cliquez sur Stocker les paramètres pour Batch et nommez-le, puis cliquez sur Ok. Des images traitées représentatives pour t = 0 et t = 24 h sont présentées dans les figures 2C et D, respectivement.
   REMARQUE : Tous les objets d’une « surface » sélectionnée peuvent être classés en ensembles en fonction de diverses propriétés données par le logiciel de conversion d’images, telles que la surface, le volume, l’intensité et la distance par rapport aux autres surfaces créées.
10. Les propriétés de surface sont trouvées en sélectionnant l’onglet Statistiques . Pour rassembler toutes les hauteurs de cellule, cliquez sur l’onglet Détaillé et sélectionnez Valeurs spécifiques et Position Z dans les menus déroulants successifs. Cliquez sur l’icône Enregistrer pour enregistrer toutes les positions z et toutes les classifications dans un fichier .xls. Répétez l’opération pour toutes les images.
11. Trouvez la position z médiane des cellules non migrantes de l’image représentative et soustrayez bien toutes les positions z en dessous de ce nombre de chaque condition de test.
    REMARQUE : Les valeurs de migration sont indiquées comme moyennes des médianes pour chaque condition de réplication technique au-dessus de la hauteur de cellule non migrante. Ils peuvent être rapportés comme la hauteur médiane, comme le montre la figure 3A, ou comme le changement de pli de la hauteur de migration pour le point temporel souhaité par rapport à t = 0, comme le montre la figure 3B.

4. Méthode PLOSMA (Parallel Layered Outward Spheroid Migration Assay) : culture cellulaire et culture de gouttelettes suspendues pour les sphéroïdes 3D

REMARQUE : Ce protocole décrit la culture cellulaire et la culture de gouttes suspendues adaptées du protocole rédigé par Nandi et ^al.14.

1. Décongeler les HDF selon le protocole du fabricant. Passage au besoin jusqu’à ce que le passage souhaité soit obtenu.
2. Dans une hotte de culture cellulaire aseptique, préparez une boîte de Pétri en ajoutant 10 ml de PBS au fond et en retournant le couvercle de sorte que l’extérieur repose sur la hotte de culture cellulaire.
3. Ajoutez le volume approprié de cellules (déterminé à partir du nombre de cellules) dans un tube de microcentrifugation. Ajouter un colorant de suivi cellulaire dilué dans le support. Porter le volume total à 1 mL avec un milieu réchauffé.
   REMARQUE : Les sphéroïdes doivent être d’environ 8000 cellules par sphéroïde, mais peuvent changer en fonction du type de cellule.
4. Incuber la solution cellulaire pendant 45 min à 37 °C. Faites tourner les cellules selon la vitesse recommandée par le fabricant et aspirez le surnageant.
5. Remettre en suspension les cellules dans de la méthylcellulose 1:100 dans le milieu.
6. Pipeter des gouttelettes de 20 μL de la solution cellule/média sur le couvercle de la boîte de Pétri.
7. Retournez le couvercle avec confiance, rapidité et précaution et placez-le sur la moitié inférieure de la boîte de Pétri contenant du PBS.
8. Incuber les gouttelettes pendant au moins 24 h.
   REMARQUE : La formation de sphéroïdes peut être surveillée par microscopie à fond clair.

5. Méthode PLOSMA (Parallel Layered Outward Sphéroïde Migration Assay) : Ensemencement de sphéroïdes cellulaires sur de l’hydrogel granulaire

REMARQUE : Le processus suivant est résumé à la figure 4A.

1. Pour mettre en place la méthode PLOSMA décrite à la figure 4A, ajoutez aseptiquement 15 μL de gel à l’aide d’une pipette à déplacement positif dans les puits d’une plaque transparente à 96 puits.
2. À l’aide d’un accessoire centrifugeuse à rotor à plaques, tournez à 1000 x g pendant 10 s pour aplatir le gel. Retournez la plaque à 180° et tournez-la à nouveau à 1000 x g pendant 10 s pour assurer une répartition uniforme du gel sur le fond du puits.
3. Une fois que la planéité uniforme a été atteinte, photo-réticuler aseptiquement le gel par le haut en appliquant une lumière focalisée (365 nm, 33,4 mW/cm²) sur l’échantillon pendant 30 s pour recuire l’échafaudage.
4. Déplacez de manière aseptique la boîte de Pétri des gouttelettes suspendues dans le capot de culture tissulaire aseptique et retournez le couvercle.
5. À l’aide d’une pipette de 20 μL, prélever lentement une gouttelette jusqu’à ce que le sphéroïde pénètre dans la pointe de la pipette. Éjectez les gouttelettes sur l’échafaudage au centre du puits.
6. Répétez les étapes précédentes pour tous les puits. Assurez-vous que chaque puits a un sphéroïde en confirmant avec une microscopie à fond clair ou à fluorescence.
7. Incuber la plaque du puits à 37 °C pendant 2 h pour permettre aux sphéroïdes de se fixer à l’échafaudage.
8. Pipetez 15 μL supplémentaires de gel sur chaque sphéroïde. Pour assurer une distribution uniforme du gel, centrifugez la plaque à 300 x g pendant 15 s dans chaque direction.
9. Recuire la couche supérieure du gel pendant 30 s à l’aide d’une lumière UV (365 nm) à 33,4 mW/cm². Pipeter le support sur le dessus de chaque échafaudage pour porter le volume total du puits à 200 μL.
   REMARQUE : Les échafaudages seront très secs à ce stade, alors ajoutez le média goutte à goutte sur le côté du puits pour éviter de détacher le sphéroïde.

6. Méthode PLOSMA (Parallel Layered Outward Sphéroïde Migration Assay) : Imagerie confocale des sphéroïdes

REMARQUE : La facilité d’imagerie dépend du système d’imagerie. Localisez le sphéroïde dans le puits à un faible temps d’exposition. Les cellules ont été imagées à l’aide du canal FITC (488 nm). Le colorant utilisé pour les cellules avait une excitation à 492 nm et une émission à 517 nm. Le grossissement 10x offre plus de détails que le grossissement 4x.

1. Trouvez le niveau d’étape le plus bas (hauteur z) auquel les cellules sont toujours actives. Définissez-la comme limite inférieure de la pile z.
2. Trouvez le niveau de scène le plus élevé (hauteur z) auquel les cellules sont encore actives. Définissez-la comme limite supérieure de la pile z.
   REMARQUE : Les meilleurs résultats d’imagerie incluent une taille de pas inférieure ou égale à 5 μm pour maintenir la résolution à l’échelle de la cellule. Il peut y avoir des compromis entre la vitesse d’imagerie et la résolution en fonction du système de microscope confocal.
3. Imagez tous les sphéroïdes comme décrit à t = 0 et 24 h. Un point temporel de 48 heures peut également être imagé en fonction des contraintes expérimentales. Des images représentatives de projection maximale de t = 0 et t = 24 sont observées à la figure 4B.

7. Méthode PLOSMA (Parallel Layered Outward Sphéroïde Migration Assay) : analyse d’images 3D

1. Importez les images dans le logiciel d’analyse comme indiqué aux étapes 3.1 à 3.4. Dans le coin supérieur droit du panneau de gauche, cliquez sur le menu déroulant du canal 1 et sélectionnez Soustraction d’arrière-plan. Appuyez sur OK en bas du panneau.
2. Une fois de retour en vue 3D, appuyez sur Ajuster automatiquement tous les canaux dans la fenêtre contextuelle de réglage de l’affichage et corrigez si nécessaire.
3. Dans la petite barre d’outils juste au-dessus du menu latéral, cliquez sur l’icône Ajouter un nouveau cadre de référence illustré à la figure 5A avec trois flèches orthogonales pour ajouter un nouvel onglet appelé « Cadre de référence 1 ».
4. Déplacez l’origine vers le centre du sphéroïde dans les trois plans, comme illustré à la figure 5B.
5. Dans la même barre d’outils que les trois flèches orthogonales, cliquez sur l’icône avec des sphères orange et ajoutez de nouveaux Spots pour créer un onglet appelé 'Spots 1'. Appuyez sur le bouton flèche bleue.
6. Sous Détection ponctuelle, définissez le diamètre XY estimé sur le diamètre estimé des cellules. Appuyez sur le bouton flèche bleue.
   REMARQUE : Pour les HDF, ce nombre est de 15,0 μm.
7. Pour le seuillage, ajustez l’histogramme d’intensité pour n’encercler que les parties les plus lumineuses. À l’aide du segmenteur, déplacez-vous vers le haut et vers le bas dans la pile d’images pour vous assurer qu’elle est aussi précise que possible. Appuyez sur la flèche bleue suivante.
8. Appuyez sur le bouton vert Exécuter pour terminer l’analyse.
9. Décochez la case Rendu sur le segment ou cliquez sur l’icône carrée jaune sur le côté droit du panneau de configuration.
10. Cliquez sur l’onglet Statistiques . Dans le premier menu déroulant, sélectionnez Valeurs spécifiques. Dans le deuxième menu déroulant, sélectionnez Distance par rapport au cadre de référence d’origine. Toutes les valeurs des surfaces sélectionnées seront affichées, comme le montre la figure 5C. Cliquez sur l’icône d’enregistrement unique, qui télécharge un fichier .xls.
11. Enregistrez les modifications apportées à l’image et aux analyses en appuyant sur l’icône Enregistrer dans la barre d’outils principale. La figure 6A représente un rendu 3D d’un sphéroïde imagé à 24 h, tandis que la figure 6B représente la fonction IMARIS Spots marquant les cellules étalées, codées en couleur en fonction de la distance par rapport au cadre de référence d’origine.
12. Normalisez les données exportées sur les images t = 0 et calculez la moyenne de la distance cellulaire parcourue et la hauteur z pour chaque sphéroïde afin d’obtenir une valeur unique pour chaque échantillon. Les figures 7A et B représentent des graphiques représentatifs pour chaque sortie, respectivement.

Résultats

Ce protocole vise à détailler les étapes nécessaires à deux nouveaux tests de migration d’échafaudage granulaire. La méthode MAMA peut être utilisée pour évaluer l’infiltration cellulaire à une interface tissulaire. Les hydrogels granulaires sont un système plus complexe que les hydrogels en vrac et, par conséquent, sont intrinsèquement plus complexes à traiter pour la migration ^9,20. Il est important de comprendre le processus par étapes décrit à la figure 1. Chaque étape s’appuie sur la suivante et a été optimisée dans ce protocole. L’ensemencement de HDF à une densité de 120 000 cellules/^cm2 entraînera une confluence d’au moins 80 % pendant la nuit (figure 1A), et il est préférable d’étiqueter ces cellules non fluorescentes avec un colorant de suivi cellulaire le jour de l’expérience afin de maximiser le potentiel d’imagerie (figure 1B). Ce protocole correspond à la force centrifuge plus faible utilisée dans le passage du HDF pour maintenir la viabilité cellulaire. En raison de l’angle produit pour une seule étape de centrifugation, il est nécessaire de retourner la plaque de 180° pour s’assurer que le gel se déplace et recouvre entièrement la surface inférieure des puits (Figure 1C). Laisser les cellules se rétablir dans l’incubateur pendant 30 minutes après le recuit (figure 1D) maintiendra la viabilité cellulaire et entraînera une migration optimale (figure 1E). Une grande zone d’une plaque de 96 puits peut être imagée avec un objectif 4x et appariée à partir d’un point temporel de 0 à 24 h (Figure 2A,B) pour évaluer largement le comportement cellulaire. Le traitement des images z-stack résultantes dans le logiciel d’analyse fournit des analyses avancées pour plusieurs grands ensembles de données dans une interface facile à utiliser. Ce protocole résume les étapes de création d’ensembles de données pour la hauteur de la cellule, ou position Z, à chaque point temporel visualisé avec les images représentatives de la figure 2B et C. L’analyse des données traitées est illustrée à la figure 3A, visualisée à l’aide de la moyenne des hauteurs médianes et de leur écart-type de chaque point temporel, et la hauteur de changement de pli à partir de cellules non migrantes à t = 0 h est illustrée à la figure 3B. Les données sous-jacentes de cette méthode sont généralement distribuées de manière anormale, de sorte que les médianes sont des mesures de comparaison plus robustes et sont donc utilisées pour résumer les données.

De même, la méthode PLOSMA peut être utilisée pour évaluer la motilité des cellules délivrées dans un échafaudage d’hydrogel granulaire 3D. La figure 4A décrit les étapes de la méthode PLOSMA, et il est particulièrement important d’ensemencer le sphéroïde au centre du puits. Il est recommandé de centrer le sphéroïde dans le champ de vision, mais cela dépend des capacités du microscope. La figure 4B présente des images représentatives de l’étalement des sphéroïdes pour t = 0 h et t = 24 h prises à un grossissement de 10x dans le canal FITC (488 nm). Dans le logiciel, un cadre de référence d’origine peut être créé et ajusté à chaque pile z (Figure 5A,B). Le logiciel peut suivre la distance radiale à partir de ce cadre de référence d’origine et l’exporter en tant qu’ensemble de données souhaité (Figure 5C). La figure 6A montre une image représentative du rendu 3D du sphéroïde t = 24 h, tandis que la figure 6B montre la fonction Spots du logiciel. La figure 7 montre un exemple des données traitées. La figure 7A représente la distance moyenne parcourue à partir du centre normalisée aux distances du jour 0. La figure 7B isole les distances parcourues uniquement dans le plan z, car c’est la direction que la méthode PLOSMA vise à étudier.

Figure 1 : Culture cellulaire et imagerie de l’essai de migration ascendante basé sur une monocouche. Schéma des principales étapes du traitement des cellules et des gels pour MAMA. (A) Les cellules sont cultivées jusqu’à la confluence pendant la nuit, et (B) Un colorant de suivi cellulaire est ajouté juste avant l’ajout de gel granulaire. L’échafaudage est assemblé par centrifugation à plaque (C) et stabilisé par photo-réticulation (D). L’imagerie à plusieurs moments permet (E) de visualiser la migration cellulaire vers le haut. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Traitement d’images MAMA. Images représentatives du traitement d’images. Comparaison des vues de dessus et de côté des images confocales brutes à (A) t = 0 et (B) t = 24 h dans le canal FITC avec un grossissement de 4x. (B) Comparaison en vue de dessus et de côté de la position de la cellule traitée : hauteurs Z à (C) t = 0 et (D) t = 24 h. Le traitement pendant 24 h comprend la soustraction des hauteurs z médianes non migratrices. Barres d’échelle = 500 μm. Abréviations : MAMA = Monolayer-based Ascending Migration Assay. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Analyse des résultats de migration des cellules MAMA. (A) Position médiane Z et écart-type des hauteurs de cellule dans chaque répétition (n = 6) aux points temporels t = 0 (27,0 μm ± 1,4 μm) et t = 24 h (46,6 μm ± 10,8 μm). (B) Migration des cellules à 24 h normalisée à 0 h et signalée comme changement de pli (1,8 ± 0,4). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Culture cellulaire et imagerie PLOSMA (Parallel Layer Outward Spheroid Migration Assay) (A) Schéma décrivant les étapes de la stratification de l’échafaudage. (B) Projections d’intensité maximale du sphéroïde prises à 0 et 24 h. Les images ont été prises par microscopie fluorescente confocale dans le canal FITC (488 nm) à un grossissement de 10x. Barres d’échelle = 200 μm. Abréviations : PLOSMA = Parallel Layer Outward Sphéroïde Migration Assay. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Création d’un nouveau repère d’origine. (A) Le bouton du nouveau cadre de référence d’origine entouré d’une boîte rouge. (B) La nouvelle origine est définie pour être au centre du sphéroïde dans les trois dimensions. (C) Les mesures de sortie indiquées sont les distances entre les surfaces des cellules et le cadre de référence d’origine, qui décrit la distance à laquelle les cellules ont migré à partir du centre. Barre d’échelle = 120 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6 : Rendus 3D du sphéroïde intégré à 24 h. (A) Sphéroïde traité dans l’espace 3D. (B) Le centre du même sphéroïde a été déterminé à l’aide de la fonction de cadre de référence d’origine dans IMARIS, et la propagation cellulaire est codée par couleur en fonction de la distance par rapport à l’origine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Exemples de sorties pour PLOSMA. (A) Exemples de résultats PLOSMA montrant la distance parcourue en μm. La distance moyenne parcourue était de 240,8 μm ± 36,87 μm. (B) Changement de pli de hauteur Z (t_f/t₀) de la germination des sphéroïdes. La variation moyenne du pli était de 3,82 ± 1,495. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole décrit deux modèles in vitro de caractérisation de la migration cellulaire en 3D pour la cicatrisation des plaies et l’intégration tissulaire. Le premier modèle, le test de migration basé sur une monocouche, repose sur des cellules correctement attachées et confluentes. Ce protocole a été développé avec un type de cellule fibroblastique et optimisé à une densité d’ensemencement de 1,20 000 cellules/cm². Cette densité permet aux cellules de croître pendant la nuit jusqu’à une confluence d’au moins 80 % uniformément au fond de la plaque de puits. Cette étape assure la migration dans la direction z dans un délai d’au moins 24 h ; Si la confluence est trop faible lors de l’ajout de la couche de gel, les cellules peuvent continuer à se propager à travers le plastique de culture tissulaire ainsi que dans le gel, entraînant un schéma de migration non uniforme et ralenti, qui a été observé lors de l’optimisation. Des hauteurs de migration inégales peuvent encore être observées dans les zones de cellules moins denses, même à 80 % de confluence. Des réplications puits réduiront le bruit de ces comportements cellulaires. Des cellules trop confluentes peuvent provoquer le soulèvement des cellules pendant la période de centrifugation et potentiellement la mort cellulaire. Cette variabilité est prise en compte en enchaînant un nombre constant de cellules et en capturant une zone d’image cohérente pour permettre des comparaisons de données appropriées. À la connaissance de l’auteur, la centrifugation sur plaque n’a pas été publiée pour l’aplatissement du gel, mais la centrifugation est couramment utilisée pour le passage cellulaire et la manipulation de la biomatière^21,22. L’ajustement de la vitesse pour correspondre aux vitesses de passage maintiendra la viabilité cellulaire pour un traitement optimal des cellules.

Le principal défi de cette méthode est de maximiser la résolution et la profondeur de l’imagerie tout en minimisant le temps d’imagerie pour garantir la meilleure analyse. Le colorant de suivi des cellules vertes est suffisamment lumineux pour imager un 96 puits avec une taille de pas de 5 μm ou moins et un temps d’exposition allant jusqu’à 1000 ms. La réduction du temps d’exposition réduit le temps pendant lequel les cellules ne sont pas dans des conditions d’incubation, mais réduit également la résolution. Ces paramètres doivent être optimisés sur une base individuelle au microscope, mais la variabilité est réduite en s’assurant que toutes les images sont capturées avec les mêmes paramètres au sein d’une seule étude.

Une remarque importante pour l’analyse des MAMA est qu’il faut éliminer les cellules à la hauteur de la monocouche ou en dessous pour s’assurer que seules les cellules en migration sont prises en compte pour les tests statistiques. En conséquence, les médianes des puits répliqués sont signalées en raison de la nature non gaussienne de la distribution des positions des cellules après filtrage. La comparaison entre les groupes peut être visualisée à l’aide d’un histogramme, et les médianes peuvent être analysées statistiquement à l’aide d’un test non paramétrique.

Malgré ces défis, la méthode de migration ascendante basée sur une monocouche est, dans sa forme la plus simple, un test reproductible pour l’infiltration de cellules 3D d’échafaudages poreux. Pour étudier les effets mécanistes de la migration cellulaire, assurez-vous que les paramètres correspondent au type de cellule étudié. Cela peut inclure l’ajout de composants chimiotactiques ou haptotactiques, dans le gel ou dans les milieux. Les milieux complets de fibroblastes dermiques humains comprennent des chimiokines migratrices, mais d’autres types de cellules qui utilisent des signaux plus spécifiques nécessitent une adaptation du test en conséquence. Ce test se prête à tester plusieurs types de variables ; Toutefois, le champ d’application de ces principes n’est pas couvert par le présent protocole. Le MAMA fournit un environnement physiologiquement pertinent analogue au mouvement cellulaire du tissu en vrac vers un hydrogel poreux injecté in vivo.

Pour la méthode PLOSMA, le placement des sphéroïdes au centre de l’échafaudage est essentiel à la réussite de l’imagerie et à la migration cellulaire significative en trois dimensions. L’ensemencement exact du sphéroïde au centre du gel dépend de l’utilisateur. À cette fin, la stabilisation de la pipette sur le barillet avec la main non dominante de l’utilisateur aide au centrage, et l’efficacité de la position d’ensemencement peut être confirmée à l’aide de la microscopie à fond clair ou fluorescente. Un sphéroïde décentré peut être corrigé par une deuxième tentative avec un nouveau sphéroïde, soit sur le même échafaudage, soit sur un nouvel échafaudage. Pour cette raison, les auteurs recommandent de créer plus de sphéroïdes que nécessaire et de préparer plus de gel MAP que nécessaire.

L’étape de centrifugation de la deuxième couche garantit que le sphéroïde est (1) recouvert uniformément par le gel et (2) capable de se propager uniformément vers le haut et vers le bas dans le gel, ce qui est crucial pour l’étude des cellules délivrées. La centrifugation peut également faire bouger le sphéroïde du centre vers les bords du puits, et bien que ce protocole limite ce phénomène en optimisant les étapes de centrifugation et le volume du gel utilisé pour chaque couche (15 μL) pour une distribution uniforme, il n’élimine pas complètement son mouvement. Il peut être nécessaire d’ajuster la vitesse et le moment exacts de la centrifugation nécessaires pour réduire le mouvement des sphéroïdes en fonction du modèle de centrifugeuse ; Cependant, la spécification décrite dans ce protocole peut être utilisée comme référence pour l’optimisation individuelle. Une autre approche consiste à laisser les sphéroïdes 2 h de temps d’incubation se fixer à l’échafaudage avant d’ajouter la deuxième couche de gel. Le mouvement des sphéroïdes est particulièrement bien atténué lorsque les deux stratégies sont mises en œuvre. Enfin, en raison du processus de centrifugation en plusieurs étapes, cette méthode peut ne pas convenir aux lignées cellulaires moins résistantes.

Outre la logistique du placage des sphéroïdes dans la méthode PLOSMA, il existe des limites lors de l’acquisition d’images. Le sphéroïde peut être imagé à l’aide d’un grossissement de 4x ou 10x, mais pour de meilleurs résultats, utilisez un grossissement d’au moins 10x et réduisez la taille du pas des piles z à 2-5 μm. Le grossissement doit être constant tout au long de l’étude. Le temps d’imagerie augmente avec la résolution plus élevée, limitez donc le nombre d’échantillons dans chaque plaque de puits (4 à 8 puits par plaque) pour minimiser le temps passé à l’extérieur de l’incubateur. Une configuration d’imagerie en direct pourrait également améliorer le suivi et fournir de meilleures informations.

Étant donné que les hydrogels granulaires ont une topologie et des paramètres de conception uniques qui incluent le volume inhérent, la porosité, la résistance mécanique et, dans certains cas, la bioactivité, il est nécessaire d’étudier le comportement cellulaire en relation avec ces aspects avec autant de fidélité que possible. La méthode PLOSMA est conçue pour modéliser le mouvement cellulaire après l’administration ou après que les cellules ont complètement pénétré dans un gel granulaire. Parce que les cellules sont forcées de migrer à travers les pores inhérents à la géométrie granulaire de l’hydrogel, la méthode PLOSMA isole efficacement la porosité en tant qu’influence sur le comportement cellulaire. Les applications potentielles de ce test sont l’administration de cellules in situ et l’intégration tissulaire dans un échafaudage granulaire, en particulier dans l’espace de cicatrisation des plaies²³.

Les deux protocoles ont été développés avec des fibroblastes dermiques humains primaires en raison du rôle de la migration des fibroblastes dans la réparation et le remodelage des tissus ^4,24, cependant, le comportement migratoire de toutes les cellules adhérentes peut être mesuré en réponse à l’altération de l’échafaudage poreux - y compris les ajouts de facteurs de croissance et la composition en surface/en vrac du gel. Ces changements peuvent nécessiter l’adaptation de ces tests pour obtenir des résultats appréciables. Les paramètres nécessitant une optimisation supplémentaire comprennent la densité d’ensemencement des cellules, la durée de l’expérience et/ou le pipeline d’analyse. IMARIS est un puissant outil d’analyse d’imagerie utilisé pour l’analyse de la migration cellulaire et possède des capacités au-delà de ce qui est décrit ici, notamment la classification de tous les objets d’une « surface » sélectionnée en ensembles basés sur diverses propriétés telles que la surface, le volume, l’intensité et la distance par rapport aux autres surfaces créées. Il existe de nombreuses ressources en ligne pour déterminer d’autres méthodes d’analyse.

Les deux méthodes décrites ici traitent non seulement de l’état initial de l’introduction tissulaire dans un matériau granulaire de manière physiologique, mais aussi de la réponse cellulaire ultérieure lorsqu’elle est entièrement intégrée dans le matériau. Comme pour tous les essais de migration, les cellules présentes sont capables de proliférer parallèlement au mouvement, mais la conception des essais décrits ne perturbe pas la prolifération et garantit donc qu’il n’y a pas d’impact indu sur l’analyse. Les deux méthodes sont compatibles avec la coloration finale en plus de l’imagerie longitudinale, qui utilise la fixation PFA pour détecter des paramètres tels que le cytosquelette, le dépôt de collagène, la prolifération, etc. L’utilisation des méthodes décrites tend vers une représentation spatio-temporelle plus précise de la migration cellulaire 3D qui utilise l’infiltration cellulaire comme paramètre mesurable, contrairement aux méthodes précédentes 1,6,14,15,25,26,27.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 Phalloidin	ThermoFisher	A22287
Bovine Serum Albumin	VWR International	332
CellTracker Green CMFDS Dye, 1 mg	ThermoFisher	C2925	20 x 50 ug units, 492/517 nm
Centrifuge	ThermoFisher	75016085	ST Plus Series
Clear 96 well plate	MilliPore Sigma	CLS3997-50EA
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	MT-25950CQC	250 mL
Fibroblast Basal Medium	ATCC	PCS-201-030	480 mL, phenol-red-free
Fibroblast Growth Kit - Low Serum	ATCC	PCS-201-041	7.5 mM L-glut,5 ng/mL rh FGF basic, 5 ug/mL rh Insulin, 1 ug/mL Hydrocortisone, 50 ug/mL Ascorbic acid, 2% FBS
FIJI (ImageJ)	NIH		Public access download
Human Dermal Fibroblasts	ATCC	PCS-201-012	Adult human dermal fibroblasts
ImageXpress Micro Confocal	Molecular Devices		Spinning Disc confocal microscope with 4x, 10x magnifications
IMARIS	Oxford Instruments		3/4D Imaged Visualizaiton and Analysis Software, Proprietary
Incubator	ThermoFisher	Finnpipette F2 Variable volume Pipettes	HeraCell Vios 160i CO2 Incubator, 165L
M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor	ThermoFisher	75003624
Methylcellulose	Fisher Scientific	9004-67-5	Lab grade, powder form
Microcentrifuge tube	Fisherbrand	05-408-129	1.5 mL microcentrifuge tubes
Paraformaldehyde (4%)	Alfa Aesar	AAJ19943K2	For fixing
Petri dish	Corning	08-757-100A	Bacteriological Petri Dishes with Lid 35 x 10 mm
Pipettes	ThermoFisher	4642080	Finnpipette F2 Variable volume Pipettes
Sterile PBS	Gibco	10010-023
Triton-X	Fisher Scientific	327371000