Commencez par placer une souris mâle euthanasiée âgée de sept à huit semaines sur une surface de banc propre. Coupez la peau abdominale de la souris avec une paire de ciseaux vers le bas-ventre. Extrayez le tissu adipeux de l’intérieur des cuisses.
Placer le tissu excisé dans le tube C sur de la glace contenant 2,5 millilitres d’un mélange enzymatique d’enzymes D, R, A et 2,35 millilitres de DMEM/F12 sans FBS ni antibiotiques. À l’aide de ciseaux, couper le tissu adipeux en morceaux d’environ deux millimètres carrés. Fermez hermétiquement le bouchon du tube C et inversez le tube.
Fixez le tube au manchon d’un dissociateur tissulaire et digérez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Ensuite, préchauffez les milieux DMEM/F12 contenant du FBS et des antibiotiques à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, retirez le tube C du dissociateur tissulaire et arrêtez la digestion en ajoutant cinq millilitres de DMEM/F12 avec FBS et antibiotiques.
Pipeter doucement quatre fois. Centrifuger la suspension à 700 g pendant 10 minutes à 20 degrés Celsius. Sans perturber la palette cellulaire, aspirez soigneusement le surnageant.
Remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de DMEM/F12 contenant du FBS et des antibiotiques, et pipeter doucement cinq fois. Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 microns de diamètre placée sur un tube de 50 millilitres. Centrifuger le filtrat à 250 g pendant cinq minutes.
Remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de PBS. Avant le placage, centrifuger la suspension cellulaire à 500 g pendant cinq minutes. Jetez le surnageant.
Remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de DMEM/F12 contenant du FBS et des antibiotiques. Mélanger en pipetant doucement la suspension, 10 fois. Plaquez 10 millilitres de suspension sur un plat enrobé de collagène de 10 centimètres.
Placez le plat dans un incubateur de culture cellulaire. Aspirez le milieu et lavez les cellules trois fois avec trois millilitres de PBS par lavage. Ajouter 10 millilitres de DMEM / F12 contenant FBS et antibiotiques et incuber.
La coloration à l’huile de rouge O a montré des adipocytes chargés de lipides sept jours après avoir induit la différenciation des adipocytes. Le degré de différenciation complète a été confirmé par l’analyse de l’expression de l’ARNm des régulateurs de l’adipogenèse. La rosiglitazone a induit un effet dose-dépendant sur les niveaux d’expression de gènes spécifiques de la graisse brune tels que Ucp1 et Ppargc1a.
Cependant, pour Fabp4, l’effet saturé à 0,1 micromole de concentration de rosiglitazone. Les adipocytes différenciés peuvent être utilisés pour diverses analyses fonctionnelles et mécanistes telles que l’analyse du taux de consommation d’oxygène et l’immunoprécipitation de la chromatine.
