Pour effectuer l’imagerie cellulaire vivante du cerveau larvaire du troisième stade, commencez par recueillir les cerveaux disséqués et les corps adipeux isolés dans le dernier puits d’une boîte de dissection à trois puits contenant la dissection et le milieu d’imagerie. Placez une membrane perméable aux gaz à l’arrière d’une glissière et appuyez sur l’anneau fendu au centre. À l’aide d’une micropipette de 200 microlitres, transférez jusqu’à 10 cerveaux disséqués avec un maximum de corps graisseux possibles et 130 à 140 microlitres du milieu sur le centre de la membrane.
Orientez les cerveaux en fonction de la population de cellules souches neurales à imager et du type de microscope, en veillant à ce que les échantillons soient proches de l’objectif du microscope. Par exemple, pour imager les cellules souches neurales dans les lobes centraux du cerveau, assurez-vous que les lobes cérébraux sont les plus proches de l’objectif. Ensuite, placez doucement un couvercle en verre sur la solution sur la membrane pour répandre la solution avec le cerveau et les corps adipeux dans toute la membrane.
Tenez le tissu de laboratoire au bord du couvercle pour éponger l’excès de solution jusqu’à ce que le cerveau touche le couvercle sans être écrasé. Ensuite, immobilisez la glissière de couverture en appliquant de la vaseline fondue le long de ses bords à l’aide d’un pinceau et laissez la gelée se solidifier. Ajoutez 400 microlitres de milieu d’imagerie à un puits dans une micro-lame multipuits.
Transférez les corps gras précédemment disséqués dans ce puits. Ensuite, placez jusqu’à 10 cerveaux dans un groupe près du centre du puits. Orientez le cerveau en fonction de la population de cellules souches neurales à imager et du type de microscope.
Laissez le cerveau s’installer dans le puits pendant deux à cinq minutes. Couvrez la micro-lame avec le couvercle de la lame avant de la transférer au microscope. Démarrez le processus d’acquisition en utilisant la puissance laser et le temps d’exposition les plus bas pour minimiser le blanchiment des photos.
L’imagerie de cerveaux larvaires exprimant la GFP de Cherry-Jupiter pilotée par UAS et marquée androgyne à l’aide de lames d’imagerie multipuits et sans supplémentation corporelle graisseuse a révélé que les broches formaient un croissant apical prononcé en divisant les neuroblastes sur lesquels les fuseaux mitotiques s’alignaient constamment pendant la mitose. Dans ces échantillons, la durée du cycle cellulaire augmentait avec l’augmentation du temps d’imagerie. Les échantillons qui ont été imagés dans un milieu supplémenté en corps gras sur une lame liée à la membrane n’ont pas montré d’augmentation de la longueur du cycle cellulaire.
De plus, des neuroblastes à quatre divisions ont été observés sur la lame membranaire de 10 heures.
