Lorsque vous travaillez sous une hotte à flux laminaire de classe deux, commencez par laver séquentiellement les tissus adipeux périvasculaires ou les PVAT prélevés sur des souris deux fois. Tout d’abord, en utilisant du PBS contenant 10 % de pénicilline-streptomycine, et, ensuite, en utilisant du PBS complété par 1 % de pénicilline-streptomycine. Transférez les tissus rincés dans une boîte de Pétri stérile de 60 millimètres et ajoutez-y 200 microlitres de solution de digestion.
À l’aide de ciseaux stériles, hachez les tissus en morceaux d’une dimension d’un millimètre cube. À l’aide de ciseaux stériles, coupez une pointe de pipette en plastique pour élargir son extrémité. Transférez ensuite le mélange de tissu haché dans un tube à centrifuger de 15 millilitres à l’aide de l’embout de pipette à large extrémité.
Ajoutez six millilitres de solution de digestion aux tissus pour initier la digestion. Après avoir attaché le tube horizontalement sur une grille, incubez-le à 37 degrés Celsius dans un agitateur orbital pendant 30 à 45 minutes. Toutes les 5 à 10 minutes, retirez le tube de l’agitateur de l’incubateur et secouez-le manuellement de haut en bas vigoureusement.
Passez le mélange de tissus digérés à travers une passoire cellulaire de 70 microns dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Rincez la passoire avec un volume égal de milieu de culture pour maximiser le rendement cellulaire et désaltérer la digestion. Transférez le filtrat dans un nouveau tube à centrifuger de 15 millilitres.
Centrifuger le tube pour isoler la fraction vasculaire stromale ou SVF. Retournez le tube pour éliminer le surnageant et remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de PBS. Centrifuger à nouveau le tube à 1 800 g pendant cinq minutes avant de jeter le surnageant.
Remettre la pastille en suspension dans un volume approprié de milieu de culture. Ensemencez les cellules dans une plaque à 12 puits recouverte de collagène et incubez-les pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humide avec 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, éliminez les débris cellulaires et les globules rouges en aspirant le milieu de culture et en lavant les cellules avec du PBS supplémenté en antibiotiques préchauffé à 37 degrés Celsius.
Enfin, ajoutez un millilitre de milieu de culture frais dans chaque puits et continuez à cultiver les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade de confluence souhaité.
