Commencez par trypsiniser les cellules souches mésenchymateuses humaines pour créer une suspension cellulaire. Ensuite, aliquote la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre pour créer 10 constructions. Après avoir centrifugé la suspension à 220 g pendant trois minutes, utilisez une pompe à vide pour éliminer le surnageant.
Maintenant, placez la pastille de cellule sur de la glace. Ensuite, amenez l’acide hyaluronique modifié au thiol, la réticulation réactive au thiol, le diacrylate de polyéthylène glycol et les bouteilles d’eau dégazées à température ambiante. Dans des conditions stériles, utilisez une seringue munie d’une aiguille pour ajouter un millilitre d’eau dégazée dans le flacon contenant de l’acide hyaluronique.
Faites vortex la solution, en la chauffant de temps en temps à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle devienne claire. Ensuite, placez la solution sur de la glace. Dans des conditions stériles, ajoutez 5 millilitres d’eau dégazée dans la bouteille de réticulation.
Dissoudre en le retournant à plusieurs reprises avant de le placer sur de la glace. Maintenant, ajoutez 120 microlitres de la solution d’acide hyaluronique dissous à la pastille cellulaire aliquoteée et remettez la pastille cellulaire en pipetant la solution d’avant en arrière. Ajouter 30 microlitres de la solution de réticulation dissoute dans le tube avec la pastille de cellules remise en suspension.
Assurez-vous de bien mélanger en tapotant sur le tube. Après avoir mélangé, faites tourner brièvement la solution. Déposez 15 microlitres de la solution combinée sur une plaque à 24 puits recouverte de paraffine.
Laissez-le se solidifier à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour la différenciation in vitro, ajouter 0,5 millilitre de milieu de différenciation chondrogénique aux hydrogels implantés dans les cellules. Après trois semaines, passez au milieu de différenciation hypertrophique, en ajoutant 0,5 millilitre par puits.
La différenciation chondrogénique a donné lieu à des glycosaminoglycanes sulfatés dans la matrice extracellulaire positive au collagène de type 2 à la fois dans l’acide hyaluronique ou HA et dans les constructions de collagène. Cependant, la distribution était plus homogène dans les constructions d’acide hyaluronique. Les constructions de collagène ont mis en évidence des cellules périphériques avec une morphologie hétérogène.
La rondeur moyenne des cellules dans les constructions HA était plus élevée que dans les constructions de collagène. Des dépôts de calcium ont été détectés sur les bords extérieurs des deux constructions à cinq semaines. Dans les constructions in vivo de l’AH, tous les implants étaient attachés les uns aux autres dans des poches sous-cutanées et formaient un tissu osseux intégré.
40% des constructions de collagène in vivo étaient indépendantes. Du tissu ostéoïde de morphologie lamellaire s’est formé dans les régions externes des deux constructions in vivo huit semaines après l’implantation. Une perte de cartilage a également été observée dans la construction de l’AH.
De multiples constructions in vivo d’AH semblaient former du tissu osseux intégré, comme l’indiquent la connexion aux tissus osseux et la présence de tissu fibreux articulaire. Alors que 40% des constructions de collagène étaient unies, les constructions restantes existaient séparément ou n’étaient attachées qu’à l’absence de connexions de tissus osseux. Les deux constructions ont montré des vaisseaux marqués positivement dans la moelle osseuse, et le cartilage interne était entouré de cellules ostéoclastes multinucléées.
Le minéral s’est déposé dans la région ostéoïde externe des deux constructions avec un volume minéral plus élevé et des constructions HA en raison de leur plus grande taille.
