Commencez par extraire l’ADN génomique des feuilles de bambou de type sauvage et infectées par Agrobacterium. Amplifier l’ADN génomique contenant le site cible des gènes cibles à partir de feuilles de bambou de type sauvage et infectées par Agrobacterium en utilisant les conditions de PCR suivantes. Après la PCR, effectuez la digestion de l’enzyme endonucléase en préparant un mélange réactionnel contenant un microlitre d’age-1, un microgramme de produits PCR et un tampon 10X de cinq microlitres.
Ensuite, ajoutez de l’eau jusqu’à un volume final de 50 microlitres. Incubez le mélange de digestion à 37 degrés Celsius pendant une heure. À l’aide de l’électrophorèse sur gel, analysez la proportion de fragments d’ADN digérés.
Comparez les fragments digérés des échantillons de type sauvage et d’échantillons infectés par Agrobacterium pour évaluer l’efficacité de l’édition de gènes. Exposez les plants de bambou à des conditions d’intensité lumineuse élevée pour augmenter la quantité de lumière absorbée et l’activation du système de photoprotection des feuilles. Ensuite, allumez le fluorimètre IMAGING-PAM et réglez l’intensité de la lumière actinique pour mesurer la fluorescence chlorophyllienne in vivo du photosystème II des feuilles de bambou.
La couleur rouge de la voie bêta produite par le gène RUBY indique une expression génique réussie médiée par Agrobacterium dans les feuilles de bambou. Sur les quatre souches d’Agrobacterium, la souche GV3101 a causé l’accumulation la plus importante de voies bêta dans les feuilles de bambou infectées. Après l’infection par les constructions CRISPR-Cas9 et les traitements à haute luminosité, certaines zones du limbe des feuilles ont montré des valeurs d’extinction non photochimiques plus faibles.
De plus, la digestion enzymatique et l’analyse de séquençage ont confirmé la mutation réussie du gène PeVDE dans les régions éditées. Les résultats du séquençage de Sanger du fragment PeVDE après édition par sgRNA1 et sgRNA2 ont montré la délétion d’un long fragment dans le gène PeVDE. Après 30 jours d’infection par Agrobacterium, les zones foliaires transfectées avec les ARNsg pour PeVDE et PeCCR5 présentaient des valeurs d’extinction non photochimiques plus faibles.
