Analyzing Protein Expression in Salidroside Treated MCF-7 Cells by Western Blotting

Commencez par ajouter deux millilitres de cellules MCF-7 contenant différents médicaments dans les puits d’une plaque à six puits. Incuber les cultures cellulaires pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Récoltez les cellules par centrifugation à 560 x g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.

Lavez ensuite les cellules deux fois avec du PBS pré-refroidi, en centrifugeant à 560 x g pendant trois minutes entre les lavages. Ajoutez 50 microlitres de tampon de lyse aux cellules lavées et placez l’échantillon dans un bain de glace pendant 15 minutes. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 8, 550 x g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et prélevez l’échantillon de protéine surnageante.

Combinez l’échantillon de protéines avec le tampon de charge dans un rapport de quatre pour un. Ensuite, dénaturez le mélange à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un bain métallique. Refroidissez ensuite le mélange à température ambiante.

Séparez l’échantillon de protéines à l’aide d’une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10 % SDS. Transférez les protéines sur une membrane PVDF de 0,22 micromètre. Après avoir bloqué la membrane avec 5 % de BSA, incubez-la avec les anticorps primaires correspondants pendant une nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, incuber la membrane avec un anticorps secondaire IgG anti-lapin de chèvre à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, développez les membranes à l’aide d’une solution de chimiluminescence ECL et capturez les images à l’aide d’un système d’imagerie par transfert Western quantitatif sans contact. Le transfert Western a montré que le traitement par salidroside favorisait l’expression protéique des facteurs pro-apoptotiques CC-9, CC-7, CC-3, Bim et Bax tout en inhibant l’expression protéique de l’anti-apoptotique BCL-2.

Le salidroside a fortement limité les rapports de p-PI3K à PI3K et de p-AKT à AKT. Pendant ce temps, l’expression des protéines de mTOR, HIF-1 alpha et Fox01 a également été considérablement supprimée.