Pour commencer, vaporisez la souris euthanasiée avec de l’alcool à 75%. Ensuite, vous avez stérilisé des ciseaux de dissection pour ouvrir la peau et exposer la cavité thoracique. Coupez le diaphragme, puis continuez à couper vers le haut vers la mâchoire inférieure et retirez soigneusement l’excès de tissus conjonctifs et de graisse exposant l’artère carotide.
Ensuite, coupez la veine cave inférieure pour faire circuler le sang hors de la circulation fermée. À l’aide d’une seringue, injectez lentement 20 millilitres de solution de perfusion pré-réfrigérée dans le ventricule gauche. Placez la souris sous un microscope stéréoscopique.
Ensuite, à l’aide de ciseaux de micro-dissection, décollez la graisse et les tissus conjonctifs autour de l’artère carotide. Isolez l’artère carotide et lavez-la avec du PBS pour éliminer tout sang résiduel. Transférez l’artère dans une plaque à six puits contenant 1,5 % de FBS sur glace.
À l’aide de ciseaux de micro-dissection, disséquez l’artère carotide longitudinalement et placez-la à plat dans une nouvelle plaque à six puits contenant un millilitre de FBS sur glace. Rincez soigneusement l’intima de l’artère avec du FBS pour éliminer le sang résiduel. Coupez l’artère en morceaux de tissu carrés de deux millimètres et transférez-les dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre.
Centrifuger à 400 g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius pour faire couler les tissus au fond. Jeter le surnageant et remettre les tissus en suspension dans 500 microlitres de réactif de dissociation A.Placer le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant une heure en pipetant doucement avec une pipette d’un millilitre toutes les 10 minutes. Ajoutez ensuite 500 microlitres de 5% FBS dans le tube et mélangez bien.
Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire stérile de 40 microns dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez le filtrat et retirez le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans 200 microlitres de réactif de dissociation B.Placez le tube dans un bain-marie pour dissocier complètement les cellules en une seule suspension cellulaire. Après cinq minutes, ajoutez 200 microlitres de 5% FBS pour mettre fin à la réaction de digestion, centrifugez la suspension et jetez le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans 100 microlitres de PBS sur glace.
Des observations microscopiques ont montré que la combinaison du réactif de dissociation B avec le réactif A conduisait à une dissociation plus complète du tissu de l’artère carotide par rapport à l’utilisation du réactif de dissociation A seul. Au total, 176 000 cellules individuelles ont été prélevées dans neuf carotides gauches, la plupart des vaisseaux vasculaires ayant été dissociés avec succès en cellules uniques à haute viabilité. Après la digestion, un regroupement non supervisé basé sur SIRAH a révélé quatre principaux types de cellules dans les artères carotides normales de souris.
