Pour commencer, préparez un milieu de culture organoïde contenant 10 micromolaires Y-27632 et 2,5 micromolaires CHIR-99021. Après avoir enduit l’ECM sur l’intestin sur puce, débranchez le tube de sortie du microcanal supérieur tout en gardant le tube de dérivation du microcanal supérieur ouvert. À l’aide d’une pince à reliure, fixez à la fois l’entrée et la sortie du microcanal inférieur.
À l’aide d’une micropipette P100, ajoutez 20 microlitres de suspension cellulaire dans l’orifice de sortie du microcanal supérieur. Fixez le tube de dérivation et d’entrée du microcanal supérieur à l’aide de clips de liaison. Rattachez le tube de sortie au trou de sortie du microcanal supérieur, en veillant à ce que le tube reste ouvert tout au long du processus.
Une fois cela fait, fixez progressivement le tube de sortie du microcanal supérieur à l’aide d’un clip de liant. Ensuite, au microscope, vérifiez que les cellules sont uniformément réparties dans le microcanal supérieur. Placez l’appareil gut-on-a-chip et un incubateur de dioxyde de carbone humidifié à 37 degrés Celsius.
Connectez la seringue attachée au microcanal supérieur de la puce à un pousse-seringue placé dans un incubateur. Réglez le débit à 30 microlitres par heure et démarrez le débit continu du fluide d’assise pour le microcanal supérieur. Pendant cette période, laissez le microcanal inférieur serré.
Le lendemain de la mise en place, remplacez le milieu par un milieu de culture organoïde contenant uniquement du A-83-01. Une fois que la monocouche est établie pour le microcanal supérieur, initiez l’écoulement continu du fluide d’assise vers le microcanal inférieur. Ensuite, introduisez un milieu de culture organoïde dans les microcanaux supérieur et inférieur pour initier le développement de la morphogenèse tridimensionnelle dans la puce.
Augmentez le débit à 50 microlitres par heure pour obtenir une contrainte pure de 0,02 dine par centimètre carré dans la conception de l’intestin sur puce. À l’aide d’un bioréacteur régulé par ordinateur, appliquez une contrainte cyclique de 10 % et une fréquence de 0,15 hertz aux cellules cultivées sur un dispositif gut-on-a-chip pendant deux à trois jours pour établir une morphogenèse tridimensionnelle. Après six à neuf jours d’écoulement moyen, un regroupement occasionnel de morphogenèse tridimensionnelle des cellules épithéliales intestinales canines a été observé dans tout le microcanal.
La coloration par immunofluorescence a permis d’évaluer la structure tridimensionnelle des monocouches dérivées d’organoïdes et des structures ressemblant à des villosités dans des puces microfluidiques. La fonction de barrière intestinale mesurée par TEER a montré des valeurs TEER stables au cinquième jour de culture.
