Pour commencer, injectez à la souris des vecteurs associés à l’AAV dans le cerveau de la souris. Après trois à quatre semaines d’injection du virus, rasez les zones ventrale et arrière du cou d’une souris anesthésiée. Nettoyez les zones rasées à l’aide de trois gommages à l’iode en rotation avec une solution à 70 % d’éthanol.
Faites une incision ventrale dans la peau entre les omoplates. Ensuite, placez de la gaze chirurgicale sur l’incision et positionnez l’animal en décubitus dorsal, la tête tournée vers le chirurgien. Faites ensuite une petite incision verticale sur le côté droit du cou, au-dessus de la clavicule, pour exposer l’artère carotide droite et la veine jugulaire.
Après avoir séparé le tissu sous-cutané, exposez la veine jugulaire externe droite et placez la suture sous la veine. Attachez l’extrémité distale de la veine jugulaire pour arrêter la circulation sanguine. À l’aide d’une micro-pince et de ciseaux, faites une petite incision dans la veine affaissée.
Maintenant, insérez le cathéter veineux avec le biseau vers le bas et déplacez-le vers la proximale vers la veine cave supérieure jusqu’à ce qu’il atteigne l’oreillette droite. À l’aide d’une suture en soie 7-0, fixez le cathéter au vaisseau. Disséquez les tissus conjonctifs pour exposer l’artère carotide commune droite.
De manière proximale, pré-placez deux boucles de suture en soie 7-0 qui restent non attachées au niveau où les artères carotides internes et externes se divisent. Pour arrêter temporairement le flux sanguin, tirez sur une boucle de suture pré-placée. Ensuite, à l’aide de micro-ciseaux ou d’une aiguille de calibre 27, créez une petite ouverture sur la paroi du récipient.
Insérez le cathéter artériel en proximal tout en relâchant l’anse de suture et avancez le cathéter pour atteindre l’arc de l’aorte, sans toucher la valve aortique. Utilisez les deux sutures préplacées pour fixer le cathéter au vaisseau. Tunneliser tous les cathéters par voie sous-cutanée, les extérioriser à l’arrière du cou via l’incision prédécoupée et fermer l’incision ventrale.
Reliez les cathéters aux orifices veineux ou artériels du connecteur de tubulure recouvert de silicone fabriqué à partir d’une tubulure à aiguille de calibre 25. Après avoir fermé l’incision ventrale, fixez le connecteur par voie sous-cutanée lorsque la peau arrière est scellée avec des sutures. À l’aide de fils chirurgicaux en acier inoxydable, remplissez les cathéters d’une solution saline héparinée et bouchez fermement les extrémités des cathéters.
Pour attacher l’animal à un système automatisé de prélèvement sanguin 24 heures après l’opération, connectez le crochet d’attache à l’anneau métallique à l’arrière du cou et connectez la ligne artérielle. Une fois le cathéter artériel connecté à la ligne d’injection, fixez les cathéters veineux aux lignes de prélèvement. Réglez le temps d’injection et la dose à 0,5 milligramme par kilogramme à 500 microlitres par minute.
Définissez la durée et la fréquence du prélèvement sanguin, y compris la dilution de l’échantillon avec une solution saline. Le système reconstituera automatiquement une quantité égale de solution saline pour remplacer le sang prélevé. Effectuer une pré-injection automatisée.
Ensuite, effectuez une injection intraveineuse automatisée du médicament clozapine N-oxyde à un taux d’injection de 500 microlitres par minute. Effectuez ensuite un prélèvement sanguin post-injection. Les profils hormonaux lutéinisants chez les femelles adultes Kiss1-EYFP ayant reçu une injection stéréotaxique unilatérale d’AAV-hM3Dq-mCherry dans le noyau arqué sont présentés.
Les taux d’hormone lutéinisante diestrus sont généralement faibles, mais des variations sont généralement observées en raison de sa libération pulsatile. Une forte augmentation des taux d’hormone lutéinisante se produit en réponse à l’injection de N-oxyde de clozapine. La plupart des neurones mCherry co-localisés avec Kiss1-EYFP ont démontré que l’activation virale et neuronale est spécifique à la population ciblée.
Un modèle de libération pulsatile de l’hormone lutéinisante chez les souris de type sauvage diestrus, suivi de la réponse à une injection IP de Kisspeptin-10, est présenté. Des impulsions claires d’hormone lutéinisante, typiques d’une femme en diestrus, ont été observées, montrant de faibles taux d’hormone lutéinisante basale. Une augmentation immédiate et robuste de l’hormone lutéinisante a été détectée en réponse à l’administration de Kisspeptin.
