Pour commencer, mettez en suspension les neutrophiles de rat isolés dans quatre millilitres de milieu RPMI supplémenté dans une boîte de Pétri stérile de 10 centimètres. Ensuite, ajoutez quatre microlitres de PMA à la suspension de neutrophiles pour déclencher la formation de TNE. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant trois heures sous 5% de dioxyde de carbone.
Pour le contrôle négatif, ajoutez quatre à cinq microlitres d’ADNASE1 à la suspension de neutrophiles pour dégrader les TNE sécrétées. Ensuite, ajoutez quatre millilitres de HBSS pour laver les TNE. Rincer la plaque avec quatre millilitres de milieu de culture frais pour chaque plaque afin de détacher les TNE.
Maintenant, récupérez le produit de lavage dans un nouveau tube et pipetez fréquemment pour assurer une remise en suspension complète des TNE. Centrifugez la suspension à 300 g pendant 10 minutes à 20 degrés Celsius pour éliminer les cellules flottantes. Ensuite, prélevez le milieu surnageant avec les TNE dans un nouveau tube.
Centrifuger la suspension des TNE et des cellules flottantes dans une plaque de 24 puits avec des lamelles de verre de 1,4 centimètre placées pour déposer les cellules flottantes. Ensuite, fixez les cellules sur les lamelles avec 4% de PFA et procédez à la vérification de la présence des TNE. Ensuite, placez une goutte de HBSS sur un support de tube à essai recouvert d’un film de paraffine.
Retournez la housse dans les gouttelettes HBSS pour la laver. Après le lavage, incubez les cellules dans 250 microlitres de 0,5x Triton X-100 pendant 10 minutes à température ambiante pour les perméabiliser. Ensuite, lavez les cellules trois fois dans HBSS pendant une minute.
Scellez les cellules dans du sérum d’ânesse normal à 10% à température ambiante pendant une heure. Enfin, incubez les cellules avec 70 à 90 microlitres d’anticorps anti-rat pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Lavez la lamelle dans HBSS trois fois pendant cinq minutes chacune.
Maintenant, incubez la lamelle dans les anticorps secondaires à température ambiante pendant une heure dans l’obscurité avant de laver un HBSS. Colorer les noyaux cellulaires et les squelettes des TNE dans 70 à 90 microlitres de DAPI. Effectuez le lavage HBSS trois fois pendant cinq minutes chacune.
