Pour commencer, enduisez une boîte de micro-puits de 150 microlitres de solution de fixation cellulaire de 0,01 % à 0,1 % avant l’incubation. Une fois le plat séché à l’air, ajoutez 80 microlitres de solution de nanoparticules d’or goutte à goutte sur la surface sèche. Le lendemain, retirez tout milieu de culture ajouté du micropuits.
Ajoutez ensuite deux millilitres des cellules transfectées au-dessus des nanoparticules d’or immobilisées à la surface du verre. Incuber la plaque avant le début de l’expérimentation. Utilisez un microscope confocal avec un laser d’organe réglé sur 488 nanomètres pour visualiser la fluorescence GFP de la protéine annexine.
Réglez le laser hélium néon à 633 nanomètres pour observer la réflexion des nanoparticules d’or. Choisissez des cellules individuelles plutôt que des amas de cellules pour éviter le chevauchement des membranes plasmiques. Assurez-vous que les nanoparticules d’or immobilisées sont présentes sous forme de particules uniques et suffisamment espacées pour éviter une augmentation du gradient thermique.
Utilisez la pince optique pour irradier la nanoparticule d’or pendant une seconde afin de perturber la membrane plasmique. Pour générer des vésicules unilamellaires géantes ou GUV, appliquez 90 microlitres de gel PVA 5% réchauffé sur une lame de verre. Étalez le gel uniformément sur la lame.
Laissez ensuite sécher la lame dans une armoire chauffante à 50 degrés Celsius pendant 50 minutes. Ensuite, utilisez une seringue en verre pour appliquer 30 microlitres de mélange lipidique. Avec le bord de l’aiguille, étalez le mélange en une fine pellicule.
Appliquez un léger débit d’azote gazeux pour évaporer le chloroforme du mélange lipidique. Séchez ensuite les lames sous vide pendant 1,5 à 2 heures. Dans un tube séparé de deux millilitres, ajoutez 400 microlitres de tampon de culture.
Ajoutez ensuite la protéine recombinante d’intérêt à une concentration finale de 500 nanomolaires. Pipeter 400 microlitres de la protéine diluée dans la chambre assemblée en interne et envelopper la chambre dans du PERIFIL. Après une incubation d’une heure, transférez 400 microlitres du contenu de la chambre dans un tube de deux millilitres.
Ajouter un millilitre de tampon d’observation dans la solution recueillie pour éliminer toutes les protéines non encapsulées. Ensuite, centrifugez la solution à 600 G pendant 10 minutes à 13 degrés Celsius. Ensuite, remplacez un millilitre de surnageant par un tampon d’observation et pipetez doucement pour disperser les GUV.
Réfrigérer jusqu’au début de l’expérimentation. Pour percer le GUV, enduisez d’abord la surface d’une boîte à fond en verre de 35 millimètres avec de la caséine bêta. Ensuite, ajoutez 5 microlitres de nano-coquilles d’or de 150 nanomètres au mélange GUV contenant du chlorure de calcium.
Transférez le mélange dans la chambre et montez-le sur la platine du microscope. Utilisez la pince optique pour piéger une nano-coquille d’or individuelle à la surface du GUV. Lorsque la nano-coquille piégée est en contact étroit avec la membrane GUV, augmentez la puissance du laser pour perforer le site cible.
L’irradiation par nanoparticules a entraîné une lésion de la membrane et a provoqué un recrutement rapide d’annexines sur le site de la lésion, à la suite de l’afflux de calcium pour former une structure en forme d’anneau. Dans les expériences GUV, la perforation de la membrane a été rapidement refermée en l’absence d’annexines. Les caractéristiques biophysiques uniques de la protéine annexine A 4 ont conduit à l’éclatement du GUV en raison de sa capacité à enrouler les membranes.
La présence d’annexine dans les GUV a provoqué une accumulation rapide au site de la lésion, à la suite d’une ponction de la membrane. L’analyse des anneaux de l’annexine A 5 dans les expériences cellulaires a montré qu’ils restaient constants dans le temps et dans l’espace. La perturbation de la membrane plasmique à l’aide de la thermoplasmonique a provoqué des niveaux élevés d’ions calcium.
Les cellules ont atteint une intensité calcique maximale à 6,6 secondes, un point de temps qui est présumé correspondre au moment de la fermeture de la plaie.
