Pour commencer, retirez l’épiploon humain fraîchement excisé du récipient de collecte à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire. Plongez l’épiploon dans du PBS pour éliminer en douceur tout résidu de sang ou de débris. À l’aide d’un scalpel et d’une pince, coupez le tissu en morceaux.
Placez les morceaux d’épiploon dans des puits individuels d’une plaque de culture à 24 puits. Remplissez ensuite les puits avec 500 microlitres de milieu de culture d’épiploon. Ajouter 10 millilitres de PBS stérile dans un flacon de culture contenant 75 % de cellules cancéreuses de l’ovaire mCherry humaines confluentes positives.
Balancez doucement la fiole pour laver les cellules. Retirez le PBS et ajoutez trois millilitres d’EDTA à 0,05 % de trypsine. Secouez doucement à nouveau le flacon de culture pour répartir uniformément la trypsine EDTA sur les cellules attachées.
Placez ensuite le flacon dans un incubateur pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Après cela, retirez le flacon de l’incubateur. Maintenant, tapotez le flacon de culture pour détacher complètement les cellules.
Ajoutez ensuite trois millilitres de milieu de culture d’épiploon pour neutraliser la trypsine. Pipetez la suspension cellulaire plusieurs fois pour bien la mélanger. Transférez la suspension dans un tube conique de 15 millilitres.
Centrifuger la suspension à 1 200 G pendant cinq minutes à 24 degrés Celsius. Maintenant, pipetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans six millilitres de milieu de culture d’épiploon frais. Prélevez 10 microlitres de la suspension cellulaire pour compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
Diluer la suspension cellulaire avec un milieu de culture frais à la densité requise. À l’aide d’une seringue d’un millilitre, prélever la suspension de cellules cancéreuses. Fixez une aiguille de calibre 26 à la seringue.
Maintenant, utilisez une paire de petites pinces chirurgicales pour ramasser un morceau de l’épiploon coupé et placez le morceau d’épiploon dans une boîte stérile de travail séparée. Injectez ensuite environ 100 microlitres de la suspension de cellules cancéreuses dans le tissu. Vous pouvez également mélanger des volumes égaux de matrice de membrane basale décongelée avec une culture d’épiploon.
Placez le mélange sur de la glace jusqu’à l’injection. Après avoir immergé les morceaux d’épiploon dans le mélange matriciel dans les puits de la plaque de culture, incubez la plaque pendant 20 minutes. Après cela, retirez la plaque de l’incubateur.
Une fois que le mélange s’est solidifié, injectez les morceaux d’épiploon avec les cellules cancéreuses. Confirmez la réussite de l’injection des cellules cancéreuses à l’aide de l’imagerie par fluorescence. Une traînée de signal fluorescent peut être vue sur les sites d’injection en guise de confirmation.
Pour faciliter la co-culture de l’épiploon et des cellules cancéreuses, ajoutez 500 à 200 microlitres de milieux frais toutes les 48 à 72 heures. Enfin, à l’aide d’un microscope à fluorescence, surveillez la croissance des tumeurs cancéreuses de l’ovaire. La croissance tumorale peut être visible en deux semaines.
Les cellules cancéreuses de l’ovaire ont été intégrées avec succès dans les morceaux d’épiploon au jour 14. Les cellules cancéreuses se sont d’abord propagées à la surface de l’épiploon au cours de la première semaine. Au fil du temps, les cellules se sont rassemblées pour former des tumeurs.
La charge tumorale a été confirmée par le changement de couleur de l’épiploon, qui est passé du rouge au jaune.
