Pour commencer, ajoutez huit millilitres de DPBS dans un tube conique stérile de 50 millilitres. À cela, ajoutez huit millilitres de sang et utilisez une pipette Pasteur en plastique de trois millilitres pour bien mélanger le contenu. Ajouter 15 millilitres de milieu d’isolement lymphocytaire dans un autre tube conique.
Inclinez le tube de 20 à 30 degrés. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur de trois millilitres, appliquez délicatement la première couche du mélange de DPBS sanguin sur le milieu d’isolement. Superposez soigneusement le reste du mélange sur la paroi latérale du tube.
Amenez lentement le tube en position verticale pour superposer le sang restant sur la couche de sang. Centrifugez le tube à 1000G pendant 10 minutes à température ambiante dans un seau oscillant avec les freins désactivés. Le mélange sanguin de PBMC se séparera en quatre couches distinctes.
À l’aide d’une pipette Pasteur, prélever les deux tiers de la couche de plasma, puis utiliser une pipette d’un millilitre pour recueillir les PBMC. Transvaser les PBMC dans un nouveau tube de 50 millilitres jusqu’à ce que toute la couche ait été récoltée. Ensuite, faites monter le volume jusqu’à 25 millilitres avec DPBS pour éliminer le milieu d’isolation résiduel et autres résidus.
Centrifugez le tube à 100G pendant 10 minutes à température ambiante avec les freins serrés. Retirez ensuite le surnageant à l’aide d’une pompe à vide. Ensuite, remettez le granulé en suspension dans un millilitre de DPBS et ajoutez plus de DPBS pour compléter le volume à 25 millilitres pour laver et remettre le granulé en suspension.
Refroidir un récipient de congélation à quatre degrés Celsius. Placez ensuite le sérum de veau fœtal sur de la glace. Remettre en suspension la pastille cellulaire contenant les PBMC isolés dans un millilitre de sérum de veau fœtal.
Ensuite, mélangez du DMSO avec du sérum refroidi sur de la glace dans un rapport de un à cinq. Transférez la suspension cellulaire dans des cryotubes étiquetés de deux millilitres, en utilisant un tube par tube de prélèvement. À l’aide d’un compteur de cellules automatisé, déterminez le nombre de cellules et leur viabilité.
Utilisez une pipette d’un millilitre pour déposer un millilitre du mélange DMSOFBS dans le tube. Placez ensuite les tubes dans le récipient de congélation pré-refroidi. Placez le récipient dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant 24 heures.
Le lendemain, sortez les tubes du congélateur et conservez-les en phase gazeuse d’azote liquide. Le nombre de cellules et la viabilité étaient constants avant et après la cryoconservation, ce qui indique une isolation et une conservation réussies.
