Pour commencer, réglez les paramètres de la station de pipette placée dans la hotte à flux laminaire sur 1 900 volts, 20 millisecondes en une seule impulsion. Retirez délicatement un tube de transfection de l’emballage pour le garder stérile et remplissez-le de trois millilitres de tampon E. Pour préparer les cellules à l’électroporation, retirez le milieu de croissance des cellules et lavez-les à l’aide de PBS pour éliminer le sérum et les cations divalents qui favorisent l’adhérence.
Ajoutez ensuite un mélange de PBS et d’EDTA millimolaire aux cellules et incubez à température ambiante pendant environ cinq minutes jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher. Pipetez doucement de haut en bas pour détacher les cellules et transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres à faible liaison protéique. Pelletez les cellules à 500 G pendant cinq minutes.
Après centrifugation, retirez rapidement la majeure partie du surnageant, en laissant environ un millilitre de surnageant dans le tube. Remettre en suspension les cellules dans le surnageant restant et le transférer dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre à faible liaison protéique. Prélever une petite aliquote de cellules pour compter et granuler les cellules restantes par centrifusion à 500 G à température ambiante pendant cinq minutes.
Comptez les cellules pendant la centrifugation. Prélevez 1x ARNsg dans une solution Cas9 à 20 millimolaires et réchauffez les tubes à température ambiante. Après centrifugation, retirez tout le surnageant de la pastille cellulaire et remettez les cellules en suspension dans du PBS avec du chlorure de calcium et du chlorure de magnésium à une concentration de 40 millions de cellules par millilitre.
Pour l’assemblage du complexe ribonucléoprotéique Cas9 de l’ARNsg, ajoutez 2,5 microlitres d’ARNsg à un microlitre de Cas9 dilué dans des tubes PCR stérilisés et distribuez lentement l’ARNsg en mélangeant pendant environ 15 secondes pour éviter la précipitation. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante pour permettre la formation du complexe ribonucléoprotéique. Pour délivrer le complexe ribonucléoprotéique par électroporation, préparez l’embout d’électroporation en appuyant sur le piston pour prolonger la tige.
Insérez ensuite la tige dans la pointe. Remettre les cellules en suspension en pipetant de haut en bas. Chargez l’embout d’électroporation avec les cellules et retirez la capacité volumique totale de 10 microlitres de l’embout.
En commençant par l’ARNsg témoin négatif, transférez 10 microlitres de cellules dans l’embout d’électroporation vers le tube d’échantillon contenant 3,5 microlitres de ribonucléoprotéine. Pipetez trois fois de haut en bas pour bien mélanger et ramassez 10 microlitres du mélange dans l’embout. Placez l’embout dans la station d’électroporation, en l’abaissant dans le tampon, et appuyez sur Start sur l’écran tactile.
Une fois l’opération terminée, l’écran indiquera une impulsion réussie. Retirez la pipette de l’appareil et placez les cellules dans un puits sec de la plaque à 12 puits non revêtue. Rincez l’embout en pipetant deux fois de haut en bas dans 15 millilitres de PBS avec du chlorure de calcium et du chlorure de magnésium.
Mettez de côté la pipette avec l’embout encore attaché. Ajoutez immédiatement un millilitre du milieu libre d’antibiotiques alicité plus tôt aux cellules et secouez doucement la plaque pour mélanger. Le chromatogramme de séquençage représentatif de Sanger du locus Rosa 26 à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse électroporés avec une ribonucléoprotéine Cas9 ARNsg contrôlée non ciblée, un ARNsg spécifique à Rosa 26 et des gènes Src et Cblb dans les macrophages édités est montré ici.
L’analyse des gènes ciblés par PCR et séquençage de Sanger montre plusieurs nucléotides à chaque position en aval du site de clivage Cas9. Ces résultats valident l’obtention d’une efficacité d’édition élevée pour de multiples gènes ciblés.
