Pour commencer, placez des lamelles en verre de 25 millimètres dans les puits d’une plaque de culture cellulaire à six puits. Placez une goutte de polylysine au centre de chaque lamelle. Une fois l’incubation terminée, laver chaque lamelle trois fois avec de l’eau distillée.
Lavez ensuite les lamelles deux fois avec une solution saline sans calcium. Ensuite, installez les couvercles dans une chambre d’enregistrement et remplissez-la de solution saline sans calcium. Recueillir les larves errantes du troisième stade du drosophile issues du croisement génétique désiré de la drosophile.
Transférez les larves dans un puits de bol, puis lavez les larves trois fois avec de l’eau distillée. Placez les larves dans un autre puits de dissection en verre contenant 750 microlitres de solution saline glacée et sans calcium. Placez maintenant une larve sous un stéréomicroscope.
À l’aide d’une pince, faites une coupe transversale à l’arrière de l’abdomen. Poussez la mâchoire avec la pince pour retourner les larves. Observez le cordon nerveux ventral à côté de la mâchoire.
Retirez soigneusement les disques imaginaux et les tissus restants du cerveau. Ensuite, séparez le cordon nerveux ventral avec le cerveau central et les lobes optiques du reste du tissu. Transférez le cordon nerveux ventral dans la chambre d’enregistrement contenant une solution saline sans calcium.
Pour éviter les interférences, fixez les nerfs restants au bas de la gaine avec une pince. Pour effectuer des expériences sur des corps adipeux, procédez à l’isolement des tissus adipeux de la larve retournée . Placez les corps graisseux isolés exprimant les capteurs de frettes dans la chambre d’enregistrement.
Pour acquérir des images de tissus exprimant des capteurs, allumez le système d’éclairage du microscope. Placez la chambre d’enregistrement contenant les cordons nerveux ventraux ou les corps adipeux sur la platine d’un microscope fluorescent. Pour visualiser la fluorescence GCaMP6f, réglez la longueur d’onde d’excitation sur 488 nanomètres.
Pour les métabolites tels que les capteurs laconiques, pyroniques, ATP ou glucose, réglez l’excitation sur 440 nanomètres. Réglez maintenant l’acquisition d’images à intervalles réguliers pour le GCaMP6f et le capteur de métabolites. Placez l’objectif d’immersion dans l’eau en veillant à ce qu’il reste immergé.
Ensuite, connectez la chambre d’enregistrement à un système de perfusion. Utilisez une pompe péristaltique à faible flux pour extraire le liquide de la chambre et maintenir un débit constant de trois millilitres par minute. Positionnez la solution contenant les tubes à 25 centimètres au-dessus de la platine du microscope.
Avant toute stimulation, obtenir une base de fluorescence stable en laissant couler la solution d’enregistrement pendant cinq à 10 minutes. Maintenant, remplacez la solution de flux par la solution de stimulation contenant du glucose, du pyruvate ou du lactate pendant cinq minutes. Capturez les images du cordon nerveux ventral stimulé qui a été exposé à 80 micromolaires de picrotoxine pour évaluer l’activité neuronale.
Les capteurs laconiques dans les cellules gliales et les motoneurones répondent à un lactate millimolaire à un rythme similaire au début du pouls. Cependant, les motoneurones atteignent une augmentation plus élevée par rapport à la ligne de base pendant l’impulsion de cinq minutes. Le signal du capteur de glucose a augmenté à un rythme similaire dans les cellules gliales et les neurones lorsqu’ils ont été exposés à cinq millimolaires de glucose.
Pendant l’impulsion de glucose, cependant, le signal dans les neurones augmente plus que dans les cellules gliales. L’élimination du transporteur Chaski a réduit le transport du lactate dans les cellules gliales. L’augmentation de l’activité neuronale induite par les picrotoxines a entraîné une baisse transitoire des niveaux d’ATP dans le soma des motoneurones.
Le capteur laconique a été observé comme étant bien exprimé dans les corps adipeux. Une fluorescence accrue des capteurs de glucose a été observée lorsque les corps adipeux étaient exposés à une concentration croissante de glucose. L’augmentation des concentrations de lactate et de pyruvate a entraîné une augmentation proportionnelle de la fluorescence laconique et pyronique.
