Pour commencer, prenez des cultures de Pseudomonas aeruginosa cultivées pendant 24 heures. Réglez ensuite sa densité optique de 600 nanomètres à 0,2 et effectuez des dilutions appropriées en utilisant 0,8% de solution saline. À l’aide d’une boucle de fil stérile, étalez la culture bactérienne sur la plaque de gélose CAS.
Incuber la plaque de gélose CAS à 30 degrés Celsius pendant 24 heures. Transférez la culture sur une plaque de microtitration à 96 puits et mesurez la densité optique à 600 nanomètres. Ensuite, transférez les cultures dans des tubes à centrifuger.
Centrifuger la culture bactérienne à 4650 g pendant 10 minutes à température ambiante. Pipeter 100 microlitres de surnageant acellulaire et l’ajouter à un puits d’une plaque à 96 puits. Ajoutez ensuite 100 microlitres de colorant CAS dans le puits.
Couvrir l’assiette de papier d’aluminium avant l’incubation. Après incubation, prenez des mesures spectrophotométriques à 630 nanomètres et calculez la quantité totale de sidérophores en pourcentage d’unité sidérophore. Pipeter 100 microlitres de surnageant acellulaire dans une plaque de microtitration à 96 puits.
Ajoutez-y ensuite 100 microlitres d’acide tris-chlorhydrique. Mesurer la lecture spectrophotométrique de la solution à 405 nanomètres. Pour l’extraction de la pyocheline, pipetez d’abord 100 millilitres de cultures cultivées pendant 48 heures de Pseudomonas aeruginosa dans des tubes à centrifuger.
Centrifuger les cultures à 4650 g pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez cinq millilitres d’acide citrique à une molaire au surnageant. Ajoutez 50 millilitres d’acétate d’éthyle à la solution pour extraire la pyochéline.
Filtrez la phase organique avec du sulfate de magnésium à travers un filtre à seringue. Conservez ensuite la phase organique à moins 20 degrés Celsius. Enfin, prenez des mesures spectrophotométriques à 320 nanomètres.
Les trois isolats cliniques et la souche de référence, PAO1, ont développé un halo orange clair lorsqu’ils ont été cultivés sur gélose CAS, ce qui indique une production de sidérophore. Des différences significatives ont été observées entre la production totale de sidérophores de l’isolat de J3 et de PAO1. Les analyses spectrophotométriques de l’extrait de pyoverdine ont montré un pic de confirmation à 380 nanomètres.
Alors que tous les isolats étaient positifs pour la production de pyoverdine, MR1 et J3 ont montré une production plus faible par rapport à la souche de référence. La présence de pyochéline a été confirmée par un pic à 320 nanomètres. Les trois isolats cliniques ont produit des volumes significativement plus élevés que PAO1.
