Différenciation hépatique de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans des cultures 2D

Pour commencer, enduire chaque puits d’une plaque de six puits d’un millilitre de matrice de membrane basale et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Retirez la matrice enrobée de la plaque et ajoutez des cellules souches pluripotentes d’origine humaine préparées dans un milieu AK02N complété par un inhibiteur de ROCK à 10 micromolaires. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois jours.

Après trois jours, au jour zéro de l’initiation de la différenciation hépatique, laver les cellules une fois avec le milieu RPMI 1640. Ensuite, pour initier la différenciation de l’endoderme, ajoutez RPMI B27 GlutaMAX complété par trois à six micromolaires CHIR 99021 et 100 nanogrammes par millilitre d’Activin A dans la plaque. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures.

Le premier jour, remplacez le milieu existant par RPMI B27 GlutaMAX complété par 50 nanogrammes par millilitre d’Activin A. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Le deuxième jour, pour induire la différenciation des progéniteurs hépatiques, remplacer le milieu existant par un milieu RPMI B27 GlutaMAX complété par 1 % de diméthylsulfoxyde et poursuivre l’incubation jusqu’à cinq jours. Le septième jour, pour amorcer la maturation des hépatocytes, passez au milieu de maturation des hépatocytes et incubez pendant 20 jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Au jour 27, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme présentaient des formes cellulaires polygonales et des noyaux arrondis, caractéristiques des hépatocytes.