Après 27 jours de début de la différenciation hépatique des cellules souches pluripotentes induites humaines, lavez les cellules avec deux millilitres de PBS par puits. Préparez la solution enzymatique dans le tampon ADS en utilisant les composants donnés. Ajouter un millilitre de solution par puits d’une plaque à six puits.
Placez la plaque à 37 degrés Celsius sur un agitateur rotatif pendant environ deux heures pour détacher les cellules de la plaque. Confirmez le détachement cellulaire au microscope, puis pipetez la suspension cellulaire pour la disperser en cellules individuelles, et collectez-les dans un tube de 50 millilitres contenant le milieu de maturation des hépatocytes. Centrifugez la suspension cellulaire à 200 G pendant cinq minutes à 18 degrés Celsius.
Et à l’aide d’un aspirateur, retirez le surnageant. Pour colorer les mitochondries des cellules, remettre la pastille en suspension dans cinq millilitres de milieu de maturation hépatocytaire contenant 100 TMRM nanomolaires. Incuber les cellules pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius tout en les protégeant de la lumière.
Encore une fois, centrifugez la suspension cellulaire et remettez la pastille en suspension dans un à cinq millilitres de tampon ADS froid contenant 2% FBS. Après le comptage des cellules, aliquote 500 000 cellules dans un tube de 1,5 millilitre et étiquetez-le comme le témoin sans anticorps primaire. Centrifugez la suspension cellulaire restante à 200 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et retirez le surnageant.
Ajouter 100 microlitres d’anticorps primaires dilués par million de cellules. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre et incubez sur de la glace pendant 50 minutes. Après l’incubation, centrifugez la suspension cellulaire et lavez-les deux fois avec un tampon ADS froid contenant 2 % de FBS.
Ajoutez maintenant 100 microlitres d’anticorps secondaires dilués par million de cellules à l’anticorps primaire, cellules colorées ou non colorées, et incubez pendant 30 minutes sur de la glace. Encore une fois, centrifugez la suspension cellulaire et lavez-les deux fois avec un tampon ADS froid contenant 2 % de FBS. Après avoir remis les cellules en suspension dans le tampon ADS, filtrez-les à travers une crépine à cellules à capuchon élastique et placez le tube sur de la glace.
