Tri cellulaire activé par fluorescence d’hépatocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines

Pour commencer, configurez la machine de tri de cellules activée par fluorescence, ou FACS, pour le tri des cellules en suivant les instructions du fabricant. Placez le tube d’échantillon sur la machine FACS et chargez-le. Gate TMRM élevée et ALCAM négative dans la région P1 pour trier les non-hépatocytes.

Ensuite, il faut surveiller la population TMRM élevée et ALCAM positive dans la région P2 pour trier les hépatocytes. Prélever les cellules triées dans des tubes de prélèvement de 15 millilitres contenant un milieu de maturation des hépatocytes. Après le tri, retirez le tube de collecte de la machine FACS.

Centrifuger la suspension de cellules triées à 200 G pendant cinq minutes à 18 degrés Celsius. Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu de maturation hépatocytaire avec 10 inhibiteurs de roche micromolaire et 20 nanomolaires de cyclosporine A. Ensemencez les cellules sur des fibroblastes embryonnaires de souris traités à la mitomycine C avec un milieu de maturation hétatocytaire dans une plaque à six puits. Cultivez les cellules dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant cinq jours avant l’immunocoloration pour le test de pureté des hépatocytes.

L’analyse FACS effectuée au jour 27 de la différenciation hépatique a révélé une population TMRM élevée et ALCAM positive. La coloration immunohistochimique des cellules P1 et P2 cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris après tri est montrée. Un test de pureté en comptant les cellules positives à l’albumine a montré 0 % de cellules P1, et environ 97 % des cellules P2 étaient des cellules de type hépatocytes.