Coloration des neutrophiles humains et préparation d’une plaque de dosage des neutrophiles pour l’analyse de cellules vivantes

Après avoir isolé les neutrophiles du sang périphérique humain, les remettre en suspension dans le milieu RPMI 1640 dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Ajoutez un microlitre de matrice d’ADN rouge perméable à la membrane à 1,5 millilitre de suspension de neutrophiles et incubez dans l’obscurité pendant cinq minutes. Centrifuger la suspension de neutrophiles à 2 500 g pendant cinq minutes à température ambiante.

Après centrifugation, retirer le tube contenant les neutrophiles granulés et aspirer le surnageant. Remettez les neutrophiles en suspension dans un millilitre de RPMI et centrifugez-le à nouveau. Après le dernier lavage, remettre les neutrophiles en suspension dans un millilitre de RPMI.

Ajoutez un petit volume de suspension de neutrophiles dans l’hémocytomètre et comptez-les au microscope. Diluer la suspension de neutrophiles à 1,5 fois 10 pour le cinquième neutrophiles par millilitre à l’aide de RPMI. Ajoutez quatre microlitres d’un à 100 colorants d’ADN vert imperméable à membrane pré-dilués au millilitre de suspension de neutrophiles.

Distribuer 100 microlitres de suspension de neutrophiles par puits dans une plaque de 96 puits traitée par culture tissulaire claire. Ajouter 100 microlitres de réactifs de stimulation contenant des réactifs de stimulation avec ou sans inhibiteur dans les puits respectifs. Placez la plaque dans un système d’analyse de cellules vivantes logé dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone.