Pour commencer, démarrez le logiciel du système d’analyse des cellules vivantes. Appuyez sur le symbole plus dans le coin supérieur gauche de l’écran pour lancer l’ajout de récipient. Choisissez Analyser selon la planification, puis sélectionnez Nouveau pour exécuter le programme d’analyse.
Sélectionnez Standard. Définissez ensuite les paramètres de numérisation en tant qu’options cellule par cellule sur Aucun et les canaux d’image sur Phase, Vert et Rouge, avec des temps d’acquisition respectifs. Définissez l’objectif sur 20x.
Dans la liste, choisissez la plaque et sélectionnez l’emplacement du récipient pour placer la plaque sur le plateau du système d’imagerie. Sélectionnez les puits contenant des échantillons et décidez du nombre d’images à capturer par puits. Ces informations génèrent automatiquement une estimation de la durée de balayage de la plaque.
Cliquez sur Créer une carte de plaque pour saisir des informations pour chaque puits, telles que le type de cellule et le composé. Ensuite, nommez l’étude. Sur l’écran suivant, sélectionnez Analyseur de base comme type d’analyse et choisissez Définition d’analyse dans la liste déroulante, qui affiche les définitions d’analyse précédemment utilisées.
Laissez le démélange spectral pour le vert et le rouge à 0,0. Planifiez l’examen toutes les 15 à 20 minutes pendant huit heures. Faites glisser la barre blanche et grise en haut de l’écran pour définir l’heure de début de l’analyse.
Sur l’écran suivant, passez en revue les paramètres d’analyse, puis appuyez sur Ajouter à la planification pour lancer l’analyse. Après la numérisation, dans l’onglet Affichage, ouvrez le récipient pour analyse. Appuyez sur Lancer l’analyse à gauche de l’écran et sélectionnez Créer une nouvelle définition d’analyse.
Choisissez Analyseur de base et utilisez les couches d’image Phase, Vert, Rouge et Chevauchement. Sélectionnez six à huit exemples d’images représentatives pour l’entraînement. Pour configurer la définition de l’analyse, définissez les objets verts sur les neutrophiles formant des pièges extracellulaires neutrophiles ou TNE, et les objets rouges sur les noyaux de tous les neutrophiles.
Appuyez sur Aperçu actuel ou Aperçu tout et ajustez chaque paramètre pour optimiser les résultats. Choisissez les temps de balayage et les puits pour l’analyse. Fournissez ensuite une étiquette pour la définition de l’analyse.
Examinez le résumé et lancez l’analyse. Après l’analyse, double-cliquez sur le nom de la définition d’analyse pour ouvrir l’étude analysée. Ouvrez Calques à gauche de l’écran et vérifiez si chaque cellule est correctement marquée.
Cliquez sur Graphiques sur les métriques à gauche de l’écran, puis sélectionnez Nombre par image pour le nombre de verts. Choisissez les points temporels et les puits à exporter. Pour sélectionner le regroupement, sélectionnez Répliqués de la carte des plaques pour confirmer que tous les puits sont correctement spécifiés lors de la numérisation, puis cliquez sur Exporter les données.
De même, exportez les données pour le nombre de rouges et le nombre de chevauchements. À l’aide de l’équation donnée, calculez le pourcentage de TNE formant des cellules pour chaque condition et chaque point temporel. L’évolution temporelle de la formation des TNE est visualisée en traçant le pourcentage de neutrophiles formant des TNE à chaque point temporel.
L’ajout d’un inhibiteur de l’AKT a bloqué la formation de TNE dans les neutrophiles stimulés par le PMA ou l’ionophore calcique. La démonstration des molécules potentielles ciblant la formation de TNE peut être testée à haut débit en utilisant cette méthodologie.
