Pour commencer l’enrobage de l’antigène, diluez l’ovalbumine à cinq microgrammes par millilitre avec un tampon d’enrobage. Enduire une plaque ELISA de 96 puits avec 100 microlitres de solution d’ovalbumine par puits pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, lavez les puits cinq fois avec PBST.
Bloquez les puits avec 250 microlitres de 1% BSA PBST à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Pour préparer une dilution sérique de 1000 X, diluez d’abord 20 microlitres de sérum pour un millilitre en utilisant 0,5% BSA PBST. Prélever ensuite 25 microlitres d’aliquote sérique et la diluer à 500 microlitres en utilisant 0,5% BSA PBST.
Ajouter 200 microlitres de sérum dilué à 1000 X sur la première rangée de la plaque revêtue. Ajoutez ensuite 100 microlitres de PBST à 0,5 % de BSA dans tous les puits sauf les puits de la première rangée. Transférez 100 microlitres de la première rangée à la deuxième rangée et mélangez 10 fois.
Pour créer des concentrations variables de sérum pour la détection des IgG, jetez 100 microlitres de liquide de la dernière rangée. Ensuite, diluez le lavage vaginal, le lavage alvéolaire des bronches, les fluides de lavage nasal avec 0,5 % de PBST BSA et le liquide de lavage de l’intestin grêle avec 20 % de PBST sérique de veau fœtal. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant une heure.
Lavez les puits cinq fois avec PBST. Ajoutez 100 microlitres d’anticorps anti-souris de chèvre conjugué HRP dans les puits appropriés et incubez à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Après avoir lavé les puits cinq fois avec du PBST, ajoutez 100 microlitres de substrat ELISA TMB et incubez dans un endroit protégé de la lumière pendant cinq minutes.
Ajouter 100 microlitres de solution d’arrêt de 450 nanomètres pour terminer la réaction. Mesurer l’absorbance à 450 nanomètres sur un lecteur de microplaques. Calculez le titre d’anticorps en définissant une valeur de réponse positive comme étant 2,1 fois la valeur sérique du groupe de souris témoins.
Le vaccin adjuvant à nano-émulsion a considérablement augmenté les titres d’anticorps IgG, IgG1 et IgG2a spécifiques de l’ovalbumine dans le sérum. Les taux d’IgA spécifiques dans le liquide de lavage vaginal et le liquide de lavage de l’intestin grêle étaient significativement augmentés lorsque l’ovalbumine était adjuvantée avec de l’acide rétinoïque encapsulé dans une nanoémulsion cationique.
