Isolement de noyaux uniques à partir d’organoïdes cérébraux humains pour le séquençage de l’ARN à noyau unique

Pour commencer, transférez quatre organoïdes cérébraux humains générés à partir de cellules souches pluripotentes induites dans une plaque à six puits contenant du PBS réfrigéré. Coupez chaque organoïde en quatre morceaux. À l’aide de ciseaux, coupez la pointe d’une pointe de pipette de 1 000 microlitres et utilisez-la pour transférer des morceaux d’organoïde dans un bec de deux millilitres.

Aspirez complètement le PBS et ajoutez un millilitre de tampon de lyse NP-40. Énoncez les organoïdes trois fois avec le pilon A suivi du pilon B.Transférez la suspension dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Lavez le dénonciateur avec un millilitre de tampon de lyse et transférez la solution dans un tube à centrifuger.

Après cinq minutes d’incubation à température ambiante, centrifuger la suspension organoïde à 500 G pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant en laissant 50 microlitres dans le tube. Ajoutez un millilitre de milieu NSB Plus dans le tube.

Et après cinq minutes, mélangez pour remettre le granulé en suspension. Après avoir préparé un dégradé Percoll dans le tube, superposez la suspension organoïde par-dessus. Ensuite, centrifugez la suspension organoïde stratifiée à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans le milieu NSB Plus. Filtrez la solution de noyaux sur une passoire à cellules de 40 microns. Ensuite, colorez les noyaux à l’aide de DAPI et comptez-les dans une chambre Neubauer.

Centrifuger la quantité requise de solution de noyaux et remettre la pastille en suspension dans le milieu NSB Plus conformément au manuel du kit de séquençage de l’ARNnb basé sur la microfluidique.