Pour commencer, étiquetez deux microtubes à centrifuger de millilitres. Pipeter 50 aliquotes de microlitres de cultures E.coli DnaK756 dans les tubes. Placez les tubes sur de la glace.
Ajoutez 10 à 50 nanogrammes d’ADN plasmidique dans chaque tube séparé avec les aliquotes d’E. coli. Gardez les tubes sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, placez les cellules à 42 degrés Celsius pendant 60 secondes pour choquer les cellules.
Remettez les tubes dans la glace pendant 10 minutes. Pipeter 950 microlitres de bouillon de tryptone de levure frais deux fois dans les tubes, puis incuber les tubes dans un shaker à 37 degrés Celsius. Pipeter 100 microlitres de la culture cellulaire transformée et les étaler sur des plaques de gélose avec deux fois du tryptone de levure contenant des antibiotiques.
Centrifuger le reste des cellules pendant une minute à 5 000 G à quatre degrés Celsius. Décantez environ 800 microlitres de bouillon. Remettre en suspension les cellules granulées dans le milieu restant.
Placez les cellules récupérées sur une plaque de gélose à la tryptone de levure deux fois, puis incubez les deux plaques de gélose à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Pour plaquer les cellules, utilisez une boucle stérile pour prélever une seule colonie des transformants. Inoculez-le dans 10 millilitres de bouillon de tryptone de levure deux fois, complété par des antibiotiques.
Maintenant, préparez des dilutions en série des cellules de 100 à 10 à la quinte négative dans des microtubes à centrifuger de deux millilitres. Avant de repérer les cellules, placez des plaques de gélose complétées par des antibiotiques et de l’IPTG dans un four à 40 degrés Celsius avec leurs couvercles partiellement ouverts. Une fois que les plaques sont suffisamment sèches, repérez deux microlitres de cellules diluées en série sur les plaques de gélose.
Placez chaque échantillon sur deux plaques distinctes. Incuber une plaque à la température de croissance permissive de 37 degrés Celsius et l’autre à la température de croissance non permissive de 43,5 degrés Celsius. Pour confirmer l’expression des protéines recombinantes, utilisez une boucle stérile pour prélever une partie des cellules restantes de la même colonie de transformants.
Inoculez les cellules dans 10 millilitres de bouillon de tryptone de levure supplémenté en antibiotiques. Incuber les cultures sur un shaker pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Toutes les cellules E.coli DnaK756 se sont développées à la température de croissance permissive de 37 degrés Celsius.
Cependant, seules les cellules hétérologues exprimant DnaK et KPf se sont développées à la température de croissance non permissive. Les cellules mutantes exprimant KPf-V436F n’ont grandi qu’à 37 degrés Celsius, mais n’ont pas réussi à croître à 43,5 degrés Celsius.
