Analyse de l’activité des chaperons Hsp70 à l’aide des analyses SDS PAGE et Western Blot de la protéine E. coli transformée

Pour commencer, pipeter 80 microlitres de cellules E.coli transformées dans un flacon. Pipeter 20 microlitres de tampon de chargement Laemmli SDS quatre fois dans le flacon. Faites bouillir la suspension à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un bloc chauffant.

Chargez ensuite 10 microlitres de l’échantillon sur un gel SDS préfabriqué. Électrophorèse le gel à température ambiante pendant une heure à 120 volts dans un tampon de fonctionnement SDS. Une fois l’électrophorèse terminée, colorez le gel dans la teinture Coomassie pendant une heure.

Décolorer le gel dans un tampon de décoloration contenant 50 % de méthanol et 10 % d’acide acétique dans de l’eau distillée pendant deux heures. Placez le gel dans un système d’imagerie sur gel pour visualiser les bandes protéiques. Ensuite, transférez les protéines du gel SDS sur une membrane de nitrocellulose.

Laver la membrane de nitrocellulose trois fois dans un tampon de lavage. Transférer la membrane dans 5 % de lait écrémé contenant des anticorps dilués dans un rapport de un à 2 000. Incuber la membrane avec les anticorps à quatre degrés Celsius tout en agitant à 60 tr/min pendant une heure.

Ensuite, laver la membrane de nitrocellulose dans le tampon d’entrejambe TBS trois fois pendant 15 minutes chacune pour éliminer tout anticorps non spécifiquement lié. Transférez maintenant la membrane dans une boîte contenant l’anticorps secondaire. Incuber la membrane à quatre degrés Celsius tout en secouant à 60 tr/min pendant une heure.

Après avoir lavé la membrane comme précédemment, utilisez un réactif de détection de chimiluminescence amélioré pour résoudre les bandes. Visualisez les bandes à l’aide d’un imageur gel.