Pour commencer, obtenez des embryons de poisson-zèbre anesthésiés dans le tampon E3. Après avoir sélectionné les embryons avec la fluorescence souhaitée, visualisez leur rythme cardiaque au microscope stéréoscopique à fond clair. À l’aide d’une pipette de transfert à pointe large, prélevez jusqu’à trois embryons et transférez-les sur une plaque d’imagerie en verre inférieure.
À l’aide d’une pipette, à l’aide d’une pipette, remplacer le milieu autour des embryons par une solution d’agarose à faible point de fusion à 1 %. À l’aide d’une pointe mince et effilée en plastique fixée à une aiguille de taquinerie, poussez doucement chaque embryon vers le bas de la plaque d’imagerie et orientez la face dorsale pour faire face au verre. Montez l’embryon dans un microscope confocal inversé.
Après avoir défini les paramètres d’acquisition du time-lapse, acquérez les images. Ouvrez le logiciel de conversion de fichiers Imaris, puis faites glisser et déposez les fichiers dans la zone de saisie. Dans le menu Sortie, désignez l’emplacement des fichiers convertis.
Cliquez sur la taille de voxel définie pour vérifier, puis appuyez sur le bouton Démarrer tout pour lancer la conversion du fichier au format IMS. Une fois lancé, laissez le logiciel d’analyse démarrer dans l’arène. Cliquez sur Observer le dossier pour ouvrir le fichier précédemment converti.
Une fois le fichier chargé dans le logiciel, cliquez sur la vue Tranche pour faire défiler la pile z. À l’aide du curseur de la barre d’outils Tranche, mesurez le diamètre des cellules après avoir dessiné le diamètre des cellules sélectionnées à l’aide du pointeur. Cliquez et faites glisser la souris pour dessiner des segments couvrant le noyau de la cellule et observez la longueur du segment dessiné dans la barre d’outils de mesure située à droite de la zone d’affichage.
Pour détecter automatiquement les cellules, revenez à la vue 3D, cliquez sur l’icône Spot dans la barre d’outils de l’objet pour ajouter un nouvel objet Spot dans la liste des objets, puis ouvrez l’assistant de création automatique de spots. Dans la première étape de l’Assistant, choisissez de segmenter uniquement une région d’intérêt. Activez ensuite l’option Suivre les points au fil du temps pour calculer les données de suivi, ainsi que les statistiques objet-objet pour permettre la comparaison entre les points et élargir la plage de données.
Cliquez sur le bouton suivant en bas à droite de la fenêtre de l’Assistant. Spécifiez une région d’intérêt, ou zone ROI, qui entoure le tectum optique de l’embryon. Cliquez et faites glisser les petites flèches blanches présentes sur chaque face de celui-ci pour modifier la taille du ROI.
Étendez-le ensuite à toutes les images enregistrées avec des ajustements d’intervalle de temps. Sélectionnez ensuite un canal source et définissez la mesure du diamètre de cellule obtenue précédemment comme diamètre XY estimé. Activez l’option Soustraction d’arrière-plan et cliquez sur Suivant.
Entrez les valeurs de seuil d’intensité directement dans les cases de seuil inférieur et supérieur pour assurer la détection de toutes les cellules. Cliquez sur Voir la zone pour observer tous ces changements en temps réel. Une fois satisfait, cliquez sur Suivant pour valider le seuillage de qualité sélectionné, et cliquez sur View Area pour visualiser les spots satisfaisant ces deux paramètres superposés sur le canal source.
Ensuite, sélectionnez le mouvement auto-agressif comme algorithme de suivi pour suivre les cellules qui ont un mouvement plus ou moins continu. Observez le mouvement des points entre deux images pour juger de la plus grande distance parcourue par une cellule entre deux points temporels et entrez un nombre estimé dans le champ de distance maximale. Pour définir la taille maximale de l’espace, si l’intervalle entre les images est inférieur à 60 secondes, utilisez une taille de trois et, pour les intervalles plus longs, augmentez-la de la même manière.
Activez le remplissage des espaces avec tous les objets détectés pour abaisser le seuil de détection et connecter les pistes. Cliquez ensuite sur Suivant et laissez le logiciel générer automatiquement des traces pour tous les spots précédemment générés. Si les pistes obtenues sont nombreuses ou fragmentées, retournez à l’assistant de création avec le bouton Précédent, et ajustez la distance maximale précédemment définie.
Pour exclure les pistes de moins de trois à huit minutes, entrez la valeur directement dans le champ de données pour la limite inférieure du filtre de durée de piste. Cliquez sur Suivant pour valider le filtre, puis passez à l’Assistant de création. Supprimez manuellement les traces générées à partir des macrophages cutanés de l’analyse pour vous concentrer sur la microglie parenchymateuse cérébrale.
À l’aide de l’éditeur de pistes, corrigez manuellement d’autres erreurs potentielles dans les pistes. Sur la droite de la zone d’affichage, activez le bouton circulaire Sélectionner le mode et mettez en surbrillance les pistes qui nécessitent des modifications ou des ajustements. Une fois la piste problématique sélectionnée, à l’aide des boutons Connecter et Déconnecter, modifiez-la pour représenter correctement les mouvements de la cellule.
Avec l’éditeur de piste, sélectionnez le mode de sélection de cercle pour supprimer les points uniques dupliqués. Si vous utilisez le rapporteur de microglie avec d’autres cellules parenchymateuses marquées par fluorescence, ajustez le diamètre XY estimé et la distance maximale par rapport à la nouvelle population cellulaire. Modifiez l’entrée du canal source dans l’image.
Enfin, à l’aide de l’onglet Statistiques, extrayez les statistiques de suivi souhaitées. Cliquez sur le bouton Paramètres et sélectionnez les statistiques de calcul de chaque objet ponctuel ou objet de surface précédemment créé. Le cerveau du poisson-zèbre embryonnaire a été imagé dans son intégralité, et l’emplacement des neurones par rapport à la microglie a été visualisé.
Les données spatiales obtenues à l’aide de ce protocole décrivent la vitesse moyenne des cellules microgliales, la distance moyenne qu’elles parcourent en une heure, leur déplacement carré moyen et leur distribution dans l’espace à différents moments.
