Pour commencer, transférez les ovaires excisés d’un poisson-zèbre dans une plaque à six puits contenant deux millilitres de solution de dissociation cellulaire. Incuber les ovaires à 28,5 degrés Celsius pendant deux à trois heures. Ajoutez deux à trois millilitres de milieu L15 préchauffé au tampon pour arrêter la digestion.
Ensuite, placez une crépine de 70 micromètres dans un autre puits de la plaque à six puits. Ajoutez le milieu L15 dans le puits, en vous assurant que le niveau moyen est plus élevé que la passoire. Maintenant, utilisez une pipette pour aspirer le milieu digestif à travers la crépine cellulaire.
Prélever l’excédent de milieu à l’aide d’une pipette. Ajoutez quatre millilitres de milieu frais L15 dans le puits et remettez doucement les ovocytes en suspension. Après quelques minutes, pipetez le surnageant.
Pour sélectionner les ovocytes pour le contrôle de la qualité, transférez-les dans une boîte de 35 millimètres de large contenant du milieu L15 frais. Observez les ovocytes au microscope optique en utilisant un grossissement de 10X ou plus. Utilisez un outil d’injection contondant pour prélever des fragments de cellules, des ovocytes de premier stade ou tout autre ovocyte de stade.
Pour confirmer le stade de croissance, ajoutez Hoechst 33342 au milieu L15 contenant les ovocytes et incubez. Observez les ovocytes avec un microscope à fluorescence sous excitation laser UV. Prélevez soigneusement les ovocytes qui ne répondent pas aux critères souhaités à l’aide d’une aiguille.
L’ovaire juvénile présentait une abondance d’ovocytes transparents de stade un accompagnés d’une population plus petite d’ovocytes de stade deux. Les ovaires de poissons adultes présentaient une prédominance d’ovocytes opaques de stade avancé deux à trois. La méthode de référence a permis d’obtenir de nombreux noyaux cellulaires de granulosa colorés à la surface des ovocytes enveloppant densément les ovocytes.
En revanche, la méthode modifiée a permis de séparer les ovocytes de la première étape dépourvus de coloration des noyaux cellulaires de la granulosa.
