Injection intracamérulaire de Hoechst pour évaluer la biodisponibilité du colorant dans la couche de cellules endothéliales cornéennes

Pour commencer, chargez cinq microlitres de solution hoechst dans une seringue Hamilton en verre stérile de 10 microlitres, attachée à une aiguille émoussée de calibre 34. Insérez cette aiguille de seringue dans la chambre antérieure à travers le tunnel cornéen auto-obturant et injectez la solution. Maintenez l’aiguille en place pendant deux à trois secondes, jusqu’à ce que tout le liquide disparaisse.

Tirez lentement l’aiguille pour la retirer, en évitant les fuites. Ensuite, énucléez les deux yeux. Pour isoler les cornées, coupez la sclérotique autour du nerf optique et faites quatre coupes supplémentaires du nerf optique vers la cornée.

Égouttez l’excès de liquide avec le papier filtre Whatman. Étalez la sclère coupée et séparez la rétine de la sclérotique. Retirez et jetez le cristallin et la rétine.

Ensuite, retirez l’iris. Coupez et jetez la sclérotique autour de la cornée. Et soulevez délicatement la cornée.

En plaçant les cornées sur une lame de verre, colorez-les avec du rouge d’alizarine à 0,5 % pour identifier les cellules endothéliales. Après avoir enlevé l’excès de tache, lavez la cornée trois fois et placez une lamelle dessus dessus. Examinez les cornées au microscope optique pour imager la coloration rouge d’alizarine des cellules endothéliales.

Évaluez également les cornées au microscope fluorescent pour observer la coloration de Hoechst et comparez-la à la cornée non injectée comme contrôle. Le colorant Hoechst, un marqueur fluorescent perméable aux cellules de liaison à l’ADN, a été utilisé pour évaluer la biodisponibilité des médicaments par injection intracamérale. L’absorption de hoechst par les cellules endothéliales cornéennes a été examinée 15 minutes après l’injection par microscopie fluorescente.

La coloration au rouge d’alizarine a mis en évidence les limites intercellulaires de la couche endothéliale. De plus, une coloration positive de Hoechst dans les noyaux des cellules endothéliales cornéennes a confirmé la bonne administration du colorant via cette méthode.