Pour commencer, prélevez des yeux de porc placés dans un bécher d’un litre. Tenez un globe oculaire à l’aide d’une pince à épiler et retirez les tissus oculaires supplémentaires avec des ciseaux dans une plaque de Pétri stérile. Pour les plaies épithéliales, tenez le globe oculaire à l’aide de lingettes stérilisées non pelucheuses et marquez le centre de la cornée avec un trépan de six millimètres.
Ensuite, à l’aide d’un petit scalpel ou d’une lame de rasoir souple émoussée dans les coins, grattez doucement les cellules épithéliales à l’intérieur du cercle marqué de trépan. Retirez tous les débris cellulaires tout en vous assurant que la membrane basale reste intacte. Ensuite, nettoyez la zone de la plaie avec des cotons-tiges.
À l’aide d’un scalpel et de ciseaux, disséquez le globe oculaire en coupant le long des bords cornéo-scléraux. Rincez ensuite les cornées dans un bécher stérilisé de 500 millilitres contenant du PBS. Ensuite, placez les cornées excisées à l’envers dans un moule stérile.
Remplissez la cavité cornéenne endothéliale avec un milieu essentiel minimum, ou MEM, contenant 1% d’agarose maintenu à 48 degrés Celsius. Maintenant, inversez et transférez les cornées dans une boîte de 35 millimètres. Ajoutez deux millilitres de MEM avec ou sans l’agent de test jusqu’à la surface de la cornée centrale, en vous assurant que la région de la conjonctive limbaire est couverte tout en laissant l’épithélium exposé à l’air.
Placez ensuite les plats de culture dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. 40 heures après la plaie, colorer les cornées cultivées blessées avec la solution de coloration Richardson. Lavez les cornées tachées avec du PBS avant de les photographier.
Ensuite, utilisez du trépan de la même taille pour marquer la plaie d’origine et, à l’aide d’un petit scalpel, grattez les cellules épithéliales à l’intérieur des cercles marqués. Retirez les cellules collectées et transférez-les dans un tube à centrifuger pré-refroidi. La surface restante de la plaie était significativement plus grande chez les cornées traitées avec du népafénac 0,1 % par rapport à celles traitées avec du bromfénac 0,09 % et du kétorolac 0,45 %Les cornées traitées avec LL-37 à 0,2 et 0,5 microgrammes par millilitre ont montré une cicatrisation significativement accélérée dans des conditions de glucose élevé par rapport aux cornées non traitées.
