Pour commencer, intégrez la larve transgénique dans de l’agarose à bas point de fusion dans une boîte à micropuits à fond de verre. Placez la parabole sur la platine microscopique du microscope inversé. Positionnez et concentrez la région souhaitée pour l’ablation au centre du champ de vision.
Choisissez les paramètres Z-stack pour imager toute la largeur de l’opercule. Imagez la zone d’intérêt de l’opercule avant l’ablation. Ensuite, dessinez une région circulaire d’un diamètre de 25 micromètres dans un plan 2D sélectionné.
Concentrez-vous sur l’opercule à l’aide de la région d’intérêt, ou outil de retour sur investissement. Pour effectuer l’ablation, appliquez une puissance d’ablation mesurée sans objectif à 450 milliwatts pendant une durée de 10 secondes. Exposez la zone sélectionnée au laser à deux photons.
Après l’ablation, confirmez la structure de l’ablation en imageant le même empilement Z avec les mêmes paramètres, comme utilisé avant l’ablation. À l’aide d’une pince ou d’une aiguille de dissection, retirez soigneusement les larves de l’agarose à bas point de fusion. Tout d’abord, retirez une couche d’agarose recouvrant les larves.
Deuxièmement, retirez l’agarose en contact direct avec les larves. Remettez les larves dans un plat avec un milieu E3 pur. Quatre ou six heures après la lésion, réimagez la région de l’opercule à l’aide de larves incrustées d’agarose aux mêmes réglages sur le même microscope.
Après avoir traité les images aux Fidji, quantifiez les cellules avec une étiquette nucléaire, ou en mesurant la surface, au cas où les cellules se chevaucheraient. Pour quantifier la zone, créez un masque englobant les macrophages. Utilisez l’outil Image, Ajuster, Seuil, créez une zone d’intérêt et analysez les particules.
Ensuite, mesurez la surface. Générez des graphiques traçant les résultats de mesure à l’aide d’un logiciel approprié. Une accumulation significative de macrophages dans la région de l’opercule ablaté a été détectée six heures après l’ablation chez les larves six jours après la fécondation.
Chez les larves quatre jours après la fécondation, le nombre de macrophages a augmenté quatre heures après la lésion. Le nombre et la surface des macrophages ont augmenté quatre heures après la lésion par rapport à l’état non ablaté.
