Dissociation cérébrale et ensemencement de neurones corticaux en culture cellulaire

Pour commencer, coupez les cerveaux isolés en morceaux dans le tube conique de 50 millilitres avec une lame de scalpel stérile jetable. Ajouter la trypsine dans le tube à une concentration finale de 0,25 %Immerger le tube dans un bain d’eau chaude à 35 à 38 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pipetez doucement la suspension tissulaire de haut en bas pour dissocier les cellules.

Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de sérum fœtal bovin à la suspension homogénéisée pour neutraliser l’activité de la trypsine. Filtrez la suspension cellulaire à travers la crépine à mailles de nylon de 70 micromètres. À l’aide d’un piston de seringue d’un millilitre, broyez doucement le tissu dans la crépine cellulaire.

Ensuite, centrifugez le tube conique à 300 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez la Poly-L-Ornithine dans les flacons T25 et rincez les flacons trois fois avec cinq millilitres de PBS. Décanter soigneusement le tube pour éliminer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire en pipetant doucement avec deux à trois millilitres de milieu neurobasal complet.

Plaquez les cellules dans les flacons T25 recouverts de poly-L-Ornithine avec environ 20 millions de cellules par ballon dans cinq millilitres de milieu neurobasal complet. Incuber la culture cellulaire à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Les neurones des flacons T25 et des plaques à 96 puits ont adhéré et formé des processus de neurite au troisième jour.

Les cultures de neurones sous-optimales contenaient des amas de cellules et des débris.