Pour commencer, coupez les mailles métalliques en bandes de 25 par 8 millimètres. Placez les mailles personnalisées dans un récipient de stérilisation et un autoclave pendant deux heures. Après l’autoclavage, placez le récipient de stérilisation et les flacons de 1,8 millilitre sous le banc à flux laminaire.
Ouvrez le récipient de stérilisation et retirez la grille métallique. Insérez la grille dans le bouchon du flacon de 1,8 millilitre et fermez le flacon. Après avoir collecté le tissu du cortex ovarien humain, retirez la moelle épinière et coupez le tissu dans les formes souhaitées.
Ajoutez cinq millilitres de solution de vitrification 1 dans le premier puits de la plaque à six puits. À l’aide de la passoire cellulaire, équilibrez le tissu du cortex ovarien pendant cinq minutes dans le puits 1 de la plaque. Déplacez la crépine cellulaire avec le tissu du cortex vers le puits 2 contenant cinq millilitres de solution de vitrification 2 et équilibrez pendant cinq minutes.
Ensuite, placez la passoire contenant le tissu cortical dans le puits 3 d’une plaque à six puits, contenant cinq millilitres de solution de vitrification 3 pendant six minutes. Remplissez le flacon cryogénique préparé avec de l’azote liquide stérilisé et placez-le dans le récipient de Dewar cryogénique rempli d’azote liquide. Chargez les échantillons de tissus sur la grille métallique de l’appareil de vitrification en une minute.
Insérez ensuite la grille métallique dans l’azote liquide dans le flacon cryogénique basé sur une grille. Ajoutez six millilitres de solution d’équilibrage dans le puits 1 d’une plaque stérile à six puits, puis transférez six millilitres de RS, chacun dans les puits 2 et 3. Incuber pendant une heure à température ambiante.
Réchauffez la solution de réchauffement rapide dans un bécher d’échantillon stérile pendant une heure sur une plaque chauffante réglée à 37 degrés Celsius. Sous le banc à flux laminaire, ouvrez les flacons cryoconservés contenant du tissu cortical ovarien vitrifié. Transférez rapidement le maillage dans la solution de réchauffement rapide.
À l’aide d’une pince stérile, transférez le tissu dans la solution d’équilibrage et incubez pendant trois minutes sur un agitateur à bascule. Ensuite, rincez le mouchoir à température ambiante pendant 10 minutes chacun avec RS1 et RS2 sur un agitateur à bascule. Dissoudre la calcéine dans 100 microlitres de DMSO.
Transférez trois microlitres de calcéine au fond d’un tube de 1,5 millilitre et conservez-le à moins 20 degrés Celsius. Ajoutez 0,007 gramme de collagénase dans un tube de 1,5 millilitre et conservez le tube à moins 20 degrés Celsius. Ajoutez 997 microlitres de DPBS aux trois microlitres de calcéine congelés et remettez en suspension pour dissoudre la calcéine.
Ajoutez ensuite de la poudre de collagénase froide pour obtenir 1000 microlitres de solution de travail. Ajoutez ensuite 500 microlitres de solution de calcéine de travail et transférez deux morceaux de deux millimètres de fragments de cortex ovarien dans les puits d’une boîte à quatre puits. Ensuite, incubez pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius, à l’abri de la lumière.
Enfin, sous microscopie à fluorescence, déterminez la viabilité folliculaire.
