DZ est pris en charge par MD Anderson Cancer Center et des subventions du NIH AI079232. MD Anderson Cancer Center est soutenu en partie par le NIH subvention CA16672.

1. Lab Problèmes de sécurité <ol><li> Tous les solvants organiques doivent être stockés dans des zones spécifiques avec un étiquetage clair. Voir les étiquettes par les fabricants pour les types d&#39;extincteurs requis. </li><li> Plusieurs réactifs utilisés sont potentiellement cancérigènes et peuvent causer la dépression mentale. Ces réactifs doivent être manipulés sous une hotte chimique avec ventilation (voir tableau des réactifs spécifiques et des équipements pour les détails). </li><li> Il est recommandé que lorsque l&#39;on travaille avec des solvants organiques et des cellules, équipement de protection individuelle tels que gants, blouse de laboratoire et une protection oculaire être utilisés à tout moment. </li></ol> 2. Extraction de Glycosphingolipides de cellules leucémiques de rat <ol><li> Boutique de cellules leucémiques de rat RBL 8 (de 10 millions à 100 millions) dans des tubes de verre 16x100 mm sous -80 ° C conditions. Les cellules sont comptées par un hémocytomètre après coloration au bleu trypan. La viabilité des cellules doit être supérieure à 95%. </li><li> Extraire les lipides en utilisant sonicat vasteions quatre fois pour 1-2 heures chaque polarité avec des solvants mixtes. Utiliser 6 ml de chloroforme-méthanol 1:1 (v / v) comme solvant premier et le dernier. Six millilitres d&#39;isopropanol: hexane: H 2 O 55:25:20 (v / v / v, retirer la phase supérieure par aspiration avant utilisation) peut alors être utilisé en tant que solvant seconde et troisième. Ce solvant est préparée par mélange isopropanol: hexane: H 2 O dans un rapport 55:25:20, en l&#39;agitant vigoureusement, et permettant une phase supérieure à apparaître, ce qui sera supprimé. Gardez la phase inférieure à l&#39;emploi. </li><li> Suivre sonication avec culot de centrifugation de la matière insoluble. Mettre en commun les surnageants. Séchez-les dans un Speedvac pendant 4 heures. Courant d&#39;azote ou d&#39;un évaporateur rotatif peut être utilisé si Speedvac n&#39;est pas disponible. Utilisez un bon piège à froid pour contenir des solvants organiques évaporés. La contamination de solvant organique dans l&#39;huile pompe à vide va se dégrader l&#39;efficacité de la pompe à vide. </li><li> Effectuer une analyse préliminaire à l&#39;aide de haute performance chromatographie sur couche mince (HPTLC). Pour quantifier les glycolipides, Préparer un Orcinol 0,2% dans une solution d&#39;acide sulfurique à 50% (100 mg dans 50 ml) et une norme galactose (40 mg dans 100 ml de solution). Préparer dans 30 pl de volume réactionnel une série de dilutions à utiliser en tant que courbe d&#39;étalonnage (à partir de 0 g / L à 20 g / L). Ajouter 20 ul de méthanol à chaque échantillon séries de dilution. Dissoudre chaque échantillon glycolipide dans 200 ul de méthanol, sonication, et utiliser 20 ul de mesure de la quantité de glycolipides. En tubes Eppendorf de 1,5 ml avec bouchon à vis (Sarstedt, 72.692.005), ajouter 0,4 ml de 0,2% en Orcinol solution d&#39;acide sulfurique 50% pour chaque échantillon, avec une série de galactose-H 2 O-méthanol solutions qui servent à la courbe d&#39;étalonnage . Faire bouillir pendant 5 min dans un bloc chauffant à 100 ° C. Lire la densité optique de la réaction colorée à 440 nm en utilisant Lever du lecteur de microplaques Tecan. À effectuer HPTLC, utiliser du chloroforme: méthanol: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) comme solvant pour les lipides neutres traités avec un mélange chloroforme-méthanol 1:1 (v / v). Utiliser isopropanol: hexane: H 2 O 55:25:20 (v / v / v)le solvant des lipides (acides gangliosides). Les GSL neutre isolé a été dissous dans 200 ul de chloroforme solvant: méthanol 1:1 (v / v) et chargé sur gel de silice Merck chromatographie sur couche mince plaque en Microcaps Drummond. Les plaques ont été réalisés dans le chloroforme solvant: méthanol: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) et séché. Les glycosphingolipides ont été visualisées par orcinol-acide sulfurique à 300 ° C. </li><li> Afin de séparer les lipides neutres des lipides acides, fraction sur les lipides neutres et acides par chromatographie échangeuse d&#39;anions sur une petite colonne de DEAE Sephadex A-25 [le DEAE Sephadex A25 résine peut être préparé en trempant Sephadex A-25 de résine poudre dans du chloroforme: méthanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) pendant une nuit. Aspirer le surnageant jusqu&#39;à ce que la résine Sephadex A25 est tout ce qui reste. Ajouter chloroforme frais: méthanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) pour laver la résine. Répétez trois fois pour éliminer les résidus chargés négativement de] Sephadex A25 résine. </li><li> Dissoudre, Soniquer (pas plus de 10 min), et remettre en suspension les lipides de l&#39;étape 2.1 dans le chloroforme: méthanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) en cas de besoin. </li><li> Préparer un petit DEAE Sephadex A25 (Cl) Formule colonne à l&#39;aide de laine de verre et un 9 &quot;pipette Pasteur. Paquet la laine de verre soigneusement afin que la poudre de résine ne passe pas à travers la colonne. Ajouter DEAE Sephadex A25 (formule Cl) à la résine&quot; cou &quot;de la 9&quot; pipette Pasteur sans laisser la colonne sèche. Assurez-vous que vous ne voyez pas toute résine dans l&#39;éluant. Les échantillons dissous dans le chloroforme: méthanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) ont été dissous. La fraction lipide neutre est la fraction d&#39;écoulement à travers. </li><li> Éluer la fraction lipidique acide (liée aux résines) avec 8 ml d&#39;acétate de sodium dans le méthanol. Séchez les deux fractions neutres et acides, les dessaler par dialyse, les sécher par Speedvac et de les analyser par HPTLC. </li></ol> La fraction acide contient gangliosides, qui peuvent être dialysés pour l&#39;étape de réaction directement 3.La fraction neutre contient non seulement les glycosphingolipides neutres, mais également les phospholipides (phosphatidylcholine et la sphingomyéline), qui doivent être éliminés par une réaction d&#39;acétylation. Dans notre expérience, la méthode d&#39;une cassette de dialyse, est plus efficace et plus pratique que d&#39;un tube de dialyse ou en phase inverse C18 colonne de chromatographie. <ol start="9"><li> La prochaine étape est l&#39;élimination des phospholipides de glycosphingolipides neutres par une acétylation et la réaction peracétylation. Sécher le Sephadex DEAE A-25 pass-through dans la fraction Speedvac (avec refroidissement) pendant 4 heures. Après les échantillons sont secs, remettez-les dans la Speedvac et sec pour un autre de 4 heures. Assurez-vous que ces échantillons sont complètement secs, comme toute l&#39;eau résiduelle permettra d&#39;éviter la réaction peracétylation. </li><li> Peracetylate les échantillons de 1 ml de pyridine et 0,5 ml d&#39;anhydride acétique dans l&#39;obscurité à température ambiante ou à 37 ° C pendant la nuit. Cette quantité d&#39;anhydride acétique et de la pyridine est bon pour un maximumà 200 ug de glycosphingolipides. Cette réaction peut être effectuée à 37 ° C, comme les GSL ont une meilleure solubilité. </li><li> Sécher la matière peracétylé par Speedvac pendant 3 heures, avec l&#39;ajout de 1 ml de toluène 3x (co-évaporation) pour assurer l&#39;évaporation complète. Si les échantillons ne sont pas encore complètement sec, Speedvac à sec. </li><li> Préparer un Florisil (Sigma-Aldrich) colonne (30-60 mesh, 10 × 80 mm) dans une pipette Pasteur avec de la laine de verre, en utilisant des perles Florisil. Perles Florisil doit être complètement sèche avant de l&#39;utiliser, par incubation dans un four à 110 ° C. Remplir les billes dans la pipette Pasteur jusqu&#39;à la nuque, et s&#39;équilibrer dans le 1,2-dichloroéthane-hexane 4:1 (v / v). </li></ol> Élution de la colonne Florisil est très rapide. La volatilité rapide des solvants peut conduire à un séchage colonnes. Ainsi, tous les mélanges de solvants doit être préparé avant d&#39;exécuter la colonne car il n&#39;est pas possible d&#39;arrêter la colonne pendant l&#39;élution. <ol start="13"><li> Appliquer le peracétyléchantillon ATED dans 1 ml de 1,2-dichloroéthane-hexane 4:1 (v / v), et laver la colonne avec 6 ml du même solvant, puis 10 ml de 1,2-dichloroéthane. Éluer neutres GSL peracétylés avec 6 ml de 1,2-dichloroéthane-acétone 1:1 (v / v). Cette étape supprime les phospholipides peracétylés de glycosphingolipides, parce que les glycosphingolipides peracétylés lier à la colonne Florisil, tout en phospholipides peracétylés pas. </li><li> Sécher les fractions par Speedvac pendant 2 heures et désacétyler avec 2 ml 0,5 M de méthylate de sodium [Sigma-Aldrich, 403067] dans 2 ml de méthanol pendant 3 heures à température ambiante. </li><li> Neutraliser le mélange avec 3 ml d&#39;acide acétique méthanolique [acide acétique / méthanol 15/85 v / v], sécher en Speedvac, dessaler par dialyse [Dissoudre les produits séchés dans 3 ml d&#39;eau, et les injecter dans le Slide-A-Lyzer Cassette dialyse, dialyse contre de l&#39;eau pendant 24 heures. Changer l&#39;eau au moins deux fois]. Sécher les GSL dialysés (en solution aqueuse) par Speedvac jusqu&#39;à ce que les échantillons soient complètement sèches. </li&gt; </ol> 3. Modification chimique (perméthylation) de Glycosphingolipides 13 <ol><li> Présentez GSL (1-20 mg) dans un tube en verre avec un bouchon à vis et un revêtement en Téflon, et ajouter le diméthylsulfoxyde (150 pi) sans utiliser des conditions particulières de séchage ou une atmosphère de gaz inerte. </li><li> Préparer l&#39;hydroxyde de sodium en poudre (40-60 mg) de particules d&#39;hydroxyde de sodium par broyage dans un mortier avec un pilon chimique. Prenez soin de stocker les poudres dans un environnement très sec et d&#39;être attentifs à faire le broyage dans la hotte chimique pour éviter de respirer les poudres. </li><li> Ajouter ensuite la poudre d&#39;hydroxyde de sodium à la solution d&#39;échantillon avec une spatule. Ajouter iodométhane (80 pi) avec une seringue de 100 microlitres Halmilton, [ou un VWR 100 microlitres calibré pipette liée à une seringue à travers un tube en caoutchouc peut être utilisé], et agiter le mélange à la température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Stopper la réaction de méthylation avec de l&#39;eau (2 ml). Extraire les produits perméthylés 3 fois parl&#39;addition de dichlorométhane (2 ml) [glycolipides sont dans la phase de dichlorométhane, qui est la phase inférieure, de sorte que la phase supérieure est transférée dans un nouveau tube en verre, et on extrait à nouveau avec du dichlorométhane]. </li><li> Laver le dichlorométhane combinés extrait 3 fois avec 2 ml d&#39;eau [la phase supérieure, qui est l&#39;eau, peuvent alors être éliminés]. Après le dernier lavage, transférer les échantillons dans un nouveau tube et sécher à l&#39;aide de la Speedvac. </li><li> Les échantillons peuvent ensuite être dissous dans 100 à 200 ul de méthanol pour analyse ESI-MS. </li></ol> 4. MALDI-TOF des Gycosphingolipids perméthylé <ol><li> Effectuer MALDI-TOF-MS et MALDI-TOF/TOF-MS/MS expériences sur un spectromètre MALDI TOF-TOF (Applied Biosystems 4700, Foster City, CA). Préparer la matrice en mélangeant un volume de 50% de 10 mg / ml d&#39;acide dihydroxybenzoïque (DHB) dans de l&#39;acétonitrile et 50% du volume d&#39;acide trifluoroacétique 0,1% (TFA) dans l&#39;eau. </li><li> La matrice DHB peut être repéré sur la targe MALDIt (1 pl), suivie d&#39;une pl 1 (contenant 100 ng GSL) place de l&#39;échantillon dissous dans le méthanol. Appliquer lentement et laissez-les sécher avant l&#39;analyse. </li></ol> 5. MS Ion Trap Analyse des Glycosphingolipides perméthylés <ol><li> Effectuer la spectrométrie de masse sur un spectromètre de masse à piège ionique linéaire (LTQ, ThermoScientific, San Jose, CA) en utilisant une source nanoelectrospray, 0,30 Débit l / min à 230 ° C de la température capillaire en mode ion positif avec une énergie de collision de 30-50%. Définir des énergies de collision de laisser une abondance résiduelle minimale de l&#39;ion précurseur. Détecter les ions comme produits d&#39;addition de sodium. </li><li> Identifier le iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) dans un mélange isobare de Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) et iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) les normes en comparant les différents modèles d&#39;ions MS produit 4 à partir de l&#39;ion moléculaire sodiated via le fragment glycane m / z 667 et le disaccharide terminal 1 - ène ion m / z 445 (c.-à-X → → 445 → 667, X désigne l&#39;ion moléculaire détectée à MS 1) de pures perméthylés iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) par l&#39;intermédiaire de normes ESI-LIT-MS avec ceux de perméthylée Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer). </li></ol>

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	<li>Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+Glycosphingolipids.">Chapter 10 Glycosphingolipids.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Bendelac, A., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17+NKT+cells+and+other+Innate-like+T+and+B+lineages.">Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages.</a> Fundamental Immunology. , (2011).</li><li>Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+shigella+diarrhea.+XI.+Isolation+of+a+shigella+toxin-binding+glycolipid+from+rabbit+jejunum+and+HeLa+cells+and+its+identification+as+globotriaosylceramide.">Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide.</a> J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).</li><li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+function+of+iGb3.">The immunological function of iGb3.</a> Curr. Protein Pept. Sci. 7 (4), 325-333 (2006).</li><li>Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+glycolipid+prevents+autoimmune+encephalomyelitis+by+inducing+TH2+bias+of+natural+killer+T+cells.">A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells.</a> Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).</li><li>Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+mapping+of+glycomes:+implications+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy.</a> Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).</li><li>Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+glycosphingolipidomics+and+NKT+cell+development+in+mouse+thymus.">Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus.</a> J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).</li><li>Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+quantitation+of+isoglobotriaosylceramide+in+the+presence+of+isobaric+components+using+electrospray+ionization-ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).</li><li>Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+isoglobo+and+globo+series+tetraglycosylceramides+in+human+thymus+by+ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).</li><li>Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+permethylation+of+glycolipid,+and+polysaccharide+catalyzed+by+methylsulfonyl+carbanion+in+dimethyl+sulfoxide.">A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide.</a> J. Biochem. (Tokyo). 55, 205 (1964).</li><li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simultaneous+methylation+of+fatty+and+hydroxy+fatty+acids+for+gas-liquid+chromatographic+analysis.">Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis.</a> Carbohydr. Res. 131, 209 (1984).</li><li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li><li>Levery, S. B., Hakomori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+methylation+analysis+of+glycolipids+using+capillary+gas+chromatography-chemical+ionization+mass+fragmentography+with+selected+ion+monitoring.">Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring.</a> Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).</li><li>Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+polyfucosylated+lactosaminoglycan+from+human+granulocytes.">Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).</li><li>Ciucanu, I., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+oxidative+degradation+during+the+per-O-methylation+of+carbohydrates.">Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 16213 (2003).</li><li>Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-butyldeoxygalactonojirimycin+inhibits+glycolipid+biosynthesis+but+does+not+affect+N-linked+oligosaccharide+processing.">N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing.</a> J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).</li><li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+47+Structural+Analysis+of+Glycans.">Chapter 47 Structural Analysis of Glycans.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+2.+FragLib:+an+MSn+spectral+library.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).</li></ol>

DZ est consultant pour Biotex, Houston, TX, et un inventeur impliqués dans les brevets liés aux technologies mentionnées dans cet article, délivrés ou en application.

Le glycome, un terme inventé par analogie avec le génome et du protéome, se réfère à toutes les structures saccharidiques d&#39;un organisme. Pour bien comprendre les multiples fonctions de glycosylation exigera une approche intégrée incluant deux études fonctionnelles et structurales glycomique. Les deux sont compliquées par la nature non-template axé sur la biosynthèse des glycanes, la complexité qui en résulte et la diversité des structures des glycanes, la participation fréquente de la structure aglycone dans la modulation des glycanes interactions ligand-récepteur au niveau moléculaire, et l&#39;importance fonctionnelle de ligands de faible abondance. Il est généralement admis que la spectrométrie de masse (MS) est une méthode indispensable pour les études en glycomique structurelles, en particulier pour l&#39;identification et la caractérisation des ligands de faible abondance. Pour observer glycanes ou glycoconjugués que les espèces moléculaires, on utilise souvent un très efficace, la méthode d&#39;ionisation faible énergie, appelée ionisation par électrospray (ESI). Pour plus d&#39;detailed caractérisation de la structure glycane, il est essentiel de choisir des espèces moléculaires individuelles et de briser les glycanes en petits morceaux. Cela se fait normalement par dissociation induite par collision, ce qui implique l&#39;activation des glycanes par collision avec les molécules de gaz inertes. L&#39;énergie a augmenté induit rupture de liaison, et l&#39;analyse systématique des fragments résultants fournit des informations sur la structure moléculaire du glycane. Souvent, &quot;signature&quot; fragments peuvent être générés qui sont de diagnostic pour certains glycanes caractéristiques structurelles. En collaboration avec la masse moléculaire, ces fragments peuvent parfois suffire pour identifier les glycanes, mais dans le passé beaucoup plus d&#39;informations a été nécessaire de bien les caractériser, en particulier si la structure est nouvelle. Ces méthodes comprennent l&#39;analyse la composition en sucre, chromatographie en phase gazeuse spectrométrie de masse partiellement méthylés acétates d&#39;alditol pour l&#39;analyse de liaison, et la digestion glycosidase spécifique 17. 18-19, plusieurs tours de la fragmentation de faible énergie, qui peut être efficacement réalisé dans un spectromètre de masse à trappe d&#39;ions (IT-MS), améliore considérablement le rendement de l&#39;analyse des informations glycane spectrométrie de masse . Avec quatre ou cinq tours de fragmentation (qui ne peut être fait avec des instruments d&#39;autres EM), il est possible de distinguer glycanes isomères qui contiennent les composants de sucre mêmes disposées dans des liaisons sucre différents, même lorsque ceux-ci sont présents ensemble dans des mélanges de composants avec le même masse moléculaire (isobares). Pour cette analyse, les glycanes ont été dérivés, en remplacement de tous les groupes hydroxyles libres avec des groupes méthyliques à l&#39;aide perméthylation. Alors que l&#39;affectation de la structure des glycanes est possible sans perméthylation, le perméthylation augmente la sensibilité à 17. Levery et Zhou, ont combiné tous les avantages potentiels de la TI-MS méthodologie, y compris la détection des isomères strumages utilisant des ions signature de diagnostic, observables seulement dans MS 4 et MS 5 spectres, pour l&#39;identification et la quantification très sensible de glycosphingolipides présents sous forme de mélanges de plusieurs isobares 7-9. En théorie, nous pourrions être en mesure d&#39;identifier chaque structure existante glycolipide, dans l&#39;attente de la disponibilité des glycolipides standard, qui peuvent être synthétisés chimiquement. Les étapes essentielles de cette analyse sont les taux de récupération de GSL à partir d&#39;échantillons biologiques. Typiquement 80 pg de GSL peuvent être récupérés à partir de 100 millions de cellules tumorales comme RBL. Pour générer suffisamment d&#39;ions moléculaires pour de multiples séries de fragmentation dans les spectromètres de masse d&#39;ions piège, au moins 10 microgrammes de GSL tumorales sont nécessaires. Faible rendement de GSL cours de la purification mènera à la faible abondance des ions, qui ne pouvaient pas être soumis à une nouvelle fragmentation. La réussite de l&#39;analyse est fonction de la quantité de GSL qui sont récupérés. En règle générale, concentration finaleentration de GSL perméthylés devrait atteindre 1 mg / ml en solution dans le méthanol, avant d&#39;être analysés sur une source de nano-électrospray. La limite pour une analyse approfondie MS n dépend de l&#39;abondance de l&#39;ion spécifique dans MS 1 profil. Une abondance d&#39;ions e typique 7 est requis pour un examen approfondi MS 5 analyse. Le faible rendement des GSL cours de la purification peut être causée par la perte de GSL lors de l&#39;étape peracétylation (qui supprime les phospholipides), lorsque les GSL par acétylés doit être liée à la colonne Florisil chromatographie sur résine, lavées et ensuite éluée. Afin d&#39;assurer la liaison de per-acétylés GSL de gel de silice, les échantillons doivent être rechargé deux fois pour la colonne de chromatographie après avoir traversé.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2 Dichloroethane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34872</td>
 <td>Carcinogenic </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>VMR</td>
 <td>JT9524-0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic anhydride</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>45830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A18P-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>C606-1 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEAE Sephadex A25 (Cl Form)</td>
 <td>GE Healthcare Biosciences</td>
 <td>AB 17&mdash;170-01 </td>
 <td>100 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Decane (anhydrous): </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>457116 </td>
 <td>100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichloroacetic acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D54702 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dialysis cassette </td>
 <td>Fischer(Pierce) </td>
 <td>66110 </td>
 <td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>20684 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl acetate </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>UN1173 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Florisil</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>46384 </td>
 <td>for packing chromatography column</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hexanes </td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0290-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodomethane </td>
 <td>Riedel de Haen, Germany</td>
 <td>03810 </td>
 <td>stabilized with silver foil Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol </td>
 <td>VWR/EMD</td>
 <td>MXO475-1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral glycosphingolipid Qualmix </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1505</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monosialganglioside mixture</td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1508</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disialoganglioside mixture </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1509</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lactosyl ceramide and sialosylderivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1511</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyridine: </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>270407 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide: </td>
 <td>BDH </td>
 <td>0292 </td>
 <td>500 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium methoxide </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>404367 </td>
 <td>0.5 M solution in methanol</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Toluene </td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>9351-03 </td>
 <td>4 L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Name of the equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber glass (glass wool)</td>
 <td>Corning Incorporated</td>
 <td>3950 </td>
 <td>Pyrex 9989 glass</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm glass tubes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-962-10B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calibrated pipettes (100 microlitter)</td>
 <td>VMR</td>
 <td>53432-921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>16x100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-961-29 </td>
 <td>With screw caps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Caps for glass tubes</td>
 <td>Kimble</td>
 <td>40566C </td>
 <td>size/13-415 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Merck TLC plates</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 29, 301-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tank for TLC</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 12,619-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drummond Microcaps </td>
 <td>Drummond scientific company</td>
 <td>1-000-0100 </td>
 <td>10 &mu;l, for loading of TLC samples</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sunrise Microplate Absorbance Reader</td>
 <td>Tecan</td>
 <td>A-5082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Whatman Chromatography Paper</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>05-716-3E</td>
 <td>18 cm x 34 cm For TLC Tank</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Orcinol ferric chloride spray reagent</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>O7875</td>
 <td>For detecting glycosphingolipids on TLC plates</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Prevel Spray Unit</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 36,555-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sonicator</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>FS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Sorvall</td>
 <td>Legend RT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Speedvac</td>
 <td>Savant</td>
 <td>AS160 </td>
 <td>With chemical trap for organic solvants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF-TOF Mass spectrometer</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Proteomics 4700 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ion Trap Mass spectrometer</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>LTQ </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

mass spectrometric analysis of glycosphingolipid antigens

Glycosphingolipides (GSL) appartiennent à la classe glycoconjugué de macromolécules biologiques, qui portent des informations structurales importantes pour les processus biologiques comme le développement embryonnaire, la transduction du signal, et la reconnaissance du récepteur immunitaire 1-2. Ils contiennent des groupements sucres complexes sous la forme d&#39;isomères, et des fractions lipidiques à des variations dont la longueur d&#39;acyle gras à chaîne, une insaturation, et l&#39;hydroxylation. Les deux parties d&#39;hydrate de carbone et de céramide peut être à la base de la signification biologique. Par exemple, les tri-hexosylceramides comprennent globotriaosylcéramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) et isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), qui ont des masses moléculaires identiques mais distincts de liaisons sucre résidu hydrate de carbone, complètement chargé de différentes fonctions biologiques 3-4. Dans un autre exemple, il a été démontré que la modification de la partie céramide de l&#39;alpha-galactosylcéramide, un ligand agoniste puissant pour invaant les cellules NKT, les changements de leur profil de sécrétion de cytokines et de fonctions dans des modèles animaux de cancer et de maladies auto-immunes 5. La difficulté à effectuer une analyse structurale des isomères dans les organes immunitaires et les cellules servent de barrière pour la détermination de nombreuses fonctions biologiques 6. Ici, nous présentons une version visualisée d&#39;une méthode d&#39;analyse relativement simple, rapide et sensible des profils de glycosphingolipides dans les cellules immunitaires 7-9. Cette méthode est basée sur la modification de l&#39;extraction et chimiques (perméthylation, voir ci-dessous la figure 5A, tous les groupes OH des hexoses ont été remplacés par MeO après réaction perméthylation) de glycosphingolipides 10-15, suivie d&#39;une analyse ultérieure en utilisant laser assistée par matrice de désorption / ionisation temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF/MS) et la spectrométrie de masse à ions piège. Cette méthode nécessite 50 millions de cellules immunitaires pour une analyse complète. Les expériences peuvent être complétés d&#39;ici une semaine. L&#39;abondance relative des différents glycosphingolipides peut être délimitée par rapport aux normes de synthèse. Cette méthode a une sensibilité de mesure de 1% parmi les iGb3 Gb3 isomères, lorsque 2 fmol du total iGb3/Gb3 mélange est présent 9. Spectrométrie de masse des ions piège peut être utilisé pour analyser les isomères. Par exemple, pour analyser la présence de globotriaosylcéramide et isoglobtriaosylceramide dans le même échantillon, on peut utiliser la fragmentation de molécules structurellement glycosphingolipides à discriminer entre les deux (voir ci-dessous figure 5). En outre, la modification chimique des fractions de sucre (par le biais d&#39;une réaction perméthylation) améliore l&#39;efficacité d&#39;ionisation et de fragmentation pour une meilleure sensibilité et spécificité, et augmente la stabilité des résidus d&#39;acide sialique. La modification chimique d&#39;extraction et de glycosphingolipides peut être réalisée dans une hotte certifiée chimique classique, et la spectrométrie de masse peut être effectué par le noyauinstallations avec des instruments d&#39;ions MS piège.

Un exemple d&#39;une analyse MALDI MS des glycosphingolipides de la leucémie chez le rat lignée cellulaire RBL (un type de cellules présentant l&#39;antigène qui présente des antigènes de glycosphingolipides dans les cellules NKT) est illustré à la figure 3. Les ions peuvent être affectés à des structures de glycosphingolipides (figure 3A). Dans les cellules RBL traités par la NB-DGJ 16, un médicament qui inhibe la synthèse des glycosphingolipides, une réduction significative de tous les glycosphingolipides a été observée (figure 3B). Isomères structurels ne peuvent pas être distingués. La capacité de MS / MS de l&#39;Applied Biosystems 4700 permet la fragmentation des ions à MS1 MS 2 fragments, ce qui permet peu d&#39;information structurelle à générer. Cependant, l&#39;analyse MS2 n&#39;est souvent pas suffisante pour discriminer isomères oligosaccharides. L&#39;analyse Ion Trap MS de glycosphingolipides permet l&#39;étude des isomères, tels que iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) et Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) qui peuvent exister sous les ions détectés trihexosylcéramide sur la figure 3A. Pour détecter de tels isomères, standard iGb3 et Gb3 ont été analysés par plusieurs tours de fragmentation, jusqu&#39;à ce que les différences ont été trouvées (figure 4A et 4B). Dans l&#39;exemple présenté ici (figure 5C) iGb3 et Gb3 peut être discriminé en comparant la norme iGb3 et Gb3. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> Figure 1. Organigramme de la procédure d&#39;extraction des glycosphingolipides, et la modification chimique de glycosphingolipides (perméthylation). Glycosphingolipides ont été extraites de cellules par des solvants organiques. Pour éliminer les non-glycosphingolipides, les lipides peuvent être peracétylé et désacétylé. Deuxièmement, les glycosphingolipides ont été modifiés chimiquement par une réaction perméthylation, ce qui améliore la sensibilité et la spécificité de MS detection. Enfin, les profils de glycosphingolipides ont été déterminés par MALDI-TOF spectrométrie de masse et spectrométrie de masse des ions piège. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> Figure 2. Quantification des glycosphingolipides par la méthode de l&#39;acide sulfurique Orcinol: Quantification des glycosphingolipides l&#39;aide d&#39;un Orcinol 0,2% dans une solution d&#39;acide sulfurique à 50% et une courbe standard de glucose. <img alt="Figure 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> Figure 3. Glycosphingolipidomics de cellules leucémiques de rat A. Représentant du spectre de masse MALDI;. Chaque ion représente une structure spécifique glycosphingolipides, les isomères structuraux ne peuvent être distingués B. NB-DGJ, un médicament qui inhibe la synthèse des glycosphingolipides, art.réduit ignificantly tous les glycosphingolipides produites dans des cellules RBL. <img alt="Figure 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> Figure 4. Spectrométrie de masse en tandem d&#39;isomères de Glycosphingolipides. A. voies de décomposition caractéristiques pour la spectrométrie d&#39;ions mode positif masse à piège de GSL perméthylés FR 3 Cer et IGB 3 Cer. Gb 3 et IGB 3 sont clairement séparés par leurs patrons de fragmentation. Les différences dans les liens se reflètent dans les 4 ions MS des produits compatibles avec les isobares m / z 445 précurseurs. B. Les résultats représentatifs montrant iGb3 peut être mesurée dans un mélange d&#39;isomères iGb3/Gb3. Les étoiles indiquent les ions diagnostiques pour iGb3 seulement. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour</a>Agrandir la figure. <img alt="Figure 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> Figure 5. Piège à ions MS permet l&#39;analyse des isomères de glycosphingolipides. A. Norme iGb3 et la différence spectacle Gb3 du profil de fragmentation après 4 tours de la fragmentation dans un piège à ions LTQ spectromètre de masse. B. Caractéristique MS 4 Profil d&#39;ions provenant de iGb3 ou Gb3. C. Trihexosyleramides sont des mélanges d&#39;isomères Gb3 iGb3 et qui peuvent être identifiés par la méthode MS piège à ions (Figure Dapeng par Zhou). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Une méthode spécifique et sensible pour mieux comprendre le profil d&#39;expression des antigènes de glycosphingolipides dans les organes et les cellules immunitaires est décrite. La méthode tire parti de la spectrométrie de masse à piège ionique permettant progressive fragmentation de molécules de glycosphingolipides pour l&#39;analyse structurelle par rapport aux normes synthétisés chimiquement.

Spectrométrie de masse des antigènes glycosphingolipides

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

mass-spectrometric-analysis-of-glycosphingolipid-antigens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.4K vues.  Rice University. Une méthode spécifique et sensible pour mieux comprendre le profil d'expression des antigènes de glycosphingolipides dans les organes et les cellules immunitaires est décrite. La méthode tire parti de la spectrométrie de masse à piège ionique permettant progressive fragmentation de molécules de glycosphingolipides pour l'analyse structurelle par rapport aux normes synthétisés chimiquement.