Les auteurs tiennent à remercier Elisabeth Blanchard pour son assistance technique. Les constatations et conclusions présentées dans ce rapport sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues des Centers for Disease Control and Prevention.

1. La culture de cellules Calu-3 pour une utilisation dans les cultures Transwell Mesures de sécurité: Effectuez toutes les procédures dans une enceinte de sécurité biologique en utilisant une technique de culture stérile. <ol><li> Pour décongeler des cellules de congélation: <ol><li> Préparer Eagle milieu essentiel minimum contenant 20% de sérum de sérum fœtal bovin (FBS), 0,1 mM non-acides aminés essentiels, 2 mM de L-glutamine, et 10 mM HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). -Filtre stérile au milieu préparé à l&#39;aide d&#39;un 0,2 um de taille de pore du filtre, et au chaud dans un bain-marie à 37 ° C. Pour être plus représentatif de l&#39;épithélium des voies aériennes dans l&#39;environnement in situ, moyen n&#39;est pas supplémenté avec des antibiotiques ou antifongiques. </li><li> Décongeler un tube cryogénique congelé des cellules Calu-3 rapidement (&lt;1 min) dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Transférer les cellules décongelées dans un tube conique de 50 ml stérile et ajouter 30 ml d&#39;EMEM chauffée-20% + S. </li><li> Granules des cellules par centrifugation pendant 5 min à 1000-1200 xg,sans réfrigération, et avec une vitesse de frein est bas. </li><li> Décanter le surnageant et remettre en suspension délicatement les cellules dans 5 ml de EMEM chauffée-20% + S en pipetant doucement de haut en bas. Graine 2 à 5 × 10 6 cellules par puits dans une plaque à 6 puits de culture de tissu et incuber à 37 ° C, CO 7% 2 dans l&#39;atmosphère de l&#39;air jusqu&#39;à ce que les cellules sont 75% - 80% de confluence. Vérifiez tous les jours, jusqu&#39;à 7 jours peut être nécessaire. Tous les 3-4 jours aspirer le fluide à partir des cellules et le remplacer avec des produits frais EMEM-20% + S. </li></ol></li><li> Pour les cellules sous-culture: <ol><li> Chaud trypsine 0,05% - 0,02% d&#39;EDTA dans un bain à 37 ° C. Aspirer le fluide à partir des cellules, et laver les cellules une fois avec de la trypsine 0,05% chaud - 0,02% d&#39;EDTA pour éliminer l&#39;excès et milieu sérique. Retirez le lavage et ajouter 1 ml de trypsine réchauffé par puits pour les cellules. </li><li> Incuber à 37 ° C et 7% de CO 2 et de contrôle au microscope toutes les 5 min jusqu&#39;à ce qu&#39;au moins 75% des cellules détacher du puits (s) de la plaque de culture tissulaire. Cela peutprendre entre 5 et 30 min. </li><li> Laver les cellules dans du EMEM-20% + S pour éliminer la trypsine excès. Transférer les cellules trypsinisées à un tube conique de 50 ml stérile. Plusieurs puits de cellules d&#39;une plaque de culture à 6 puits peuvent être regroupés en un seul tube conique de 50 ml stérile. Ajouter 30 ml de EMEM-20% + S et sédimenter les cellules par centrifugation à 1000-1200 xg, sans réfrigération, et avec une vitesse de frein est bas. </li><li> Décanter le surnageant et remettre en suspension délicatement les cellules en eau douce EMEM-20% + S en pipetant doucement de haut en bas. En utilisant les étapes 1.2.1 1.2.3 ci-dessus par le biais de trypsiniser cellules, les cellules continuent de sous-culture dans des boîtes de culture de tissus comme décrit dans les étapes 1.2.5 1.2.7 travers quand ils sont entre 75 - 80% de confluence. </li><li> Subculture d&#39;un puits d&#39;une plaque à 6 puits jusqu&#39;à un T-flacon de 25 cm2 dans un volume final de 5 ml de EMEM-20% + S, l&#39;ensemencement de 0,5 à 1 × 10 6 cellules / flacon. </li><li> Avec 5 ml de trypsine réchauffé par T-flacon de 25 cm2 pour détacher les cellules, sous-cultured&#39;un T-25 cm 2 jusqu&#39;à une fiole T-75 cm 2 ballon dans un volume final de 10 ml de milieu EMEM-20% + S, entre l&#39;ensemencement de 1 à 5 x 10 6 cellules / flacon. </li><li> Utilisation 8 ml réchauffé par la trypsine T-flacon de 75 cm2 pour détacher les cellules, d&#39;une sous-culture T-75 cm 2 en 2 flacon T-75 cm 2 flacons. Pour une croissance optimale des cellules, les cellules ne sont pas sous-culture dans des flacons de plus de T-75 cm 2 ou sous-culture à un ratio supérieur à 1 flacon parent: 3 nouveaux flacons. </li></ol></li><li> Une fois que les cellules ont été repiquées, supprimer complètement et remplacer milieu tous les 2 à 3 jours jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent la confluence 75-90%. Les cellules peuvent prendre jusqu&#39;à 3 semaines pour atteindre 75-90% de confluence. Pour la génération optimale des cultures de cellules polarisées, subculture, avant qu&#39;ils cultivent au-delà de 90% de confluence en monocouche. </li><li> Continuer jusqu&#39;à ce que la sous-culture de cellules suffisamment de cellules se sont développées pour ensemencer le nombre désiré d&#39;inserts Transwell. Chaque insert Transwell exige 2 × 10 5 cellules. Pour des performances optimales générer cultures polarisés, utiliser des cellules qui ont subi pas plus de 10 sous-cultures. </li></ol> 2. Croissance Polarized Calu-3 Liquide couvertes de cultures (LCC) Mesures de sécurité: Effectuez toutes les procédures dans une enceinte de sécurité biologique en utilisant une technique de culture stérile. <ol><li> Préparer EMEM contenant 10% de FBS (EMEM-10%) et au chaud dans un bain-marie à 37 ° C. </li><li> Préparer une plaque de 24 puits Transwell pour l&#39;ensemencement. En utilisant une pince stérile, déplacer inserts Transwell de l&#39;intérieur aux lignes extérieures de la plaque sans toucher la membrane insert. Les cellules ne doivent être repiquées dans des puits sur les lignes extérieures de la plaque. Pour éviter l&#39;introduction de bulles d&#39;air dans les compartiments basolatéral, ajouter 600 ul de milieu EMEM-10% à chacun en inclinant la pipette contre la paroi de chaque compartiment et relâchant lentement le support dans le puits. </li><li> Détacher les cellules de T-75 cm 2 de tissu. Par voie sousflacons lture l&#39;aide de trypsine réchauffé, et laver dans 30 ml de EMEM-20% + S pour tous les 2 flacons de cellules trypsinisées, tel que décrit à l&#39;étape 1.2. </li><li> Bien remettre en suspension les cellules lavées dans 5 ml de EMEM-10% en pipetant doucement de haut en bas. </li><li> Déterminez nombre de cellules viables totales par la méthode d&#39;exclusion au bleu trypan. Effectuez cette opération uniquement si 80% - 90% sont viables. </li><li> 50 ml dans un tube conique stérile, diluer les cellules à une concentration de 2 x 10 6 cellules viables / ml avec EMEM-10%. </li><li> Ajouter à cellules du compartiment apical de chaque Transwell. Pour les puits A1 et D1, qui seront des puits de contrôle acellulaires, qui est, flans, ajouter 100 ul de MEM-10% sans cellules. Pour chacun des puits restants, ajouter 100 ul d&#39;extrait cellules Calu-3, pêche à la ligne doucement la pipette contre le canal de guidage intérieur de la paroi d&#39;insertion et libérant lentement les cellules. Ne touchez pas la pipette sur la membrane d&#39;insertion. Afin de maintenir une suspension homogène de cellules Calu-3, agiter doucement la suspension cellulaireau cours de cette étape d&#39;ensemencement. </li><li> Incuber Transwell plaque à 37 ° C et 7% de CO 2 dans l&#39;atmosphère de l&#39;air. Placer la plaque dans un incubateur où les perturbations physiques seront minimes. Pour améliorer l&#39;efficacité de polarisation, ne pas empiler les plaques les unes sur les autres. </li><li> Pour maintenir les cultures jusqu&#39;à polarisée et prête à l&#39;emploi dans les expériences, remplacer complètement milieu dans Transwells, comme décrit dans les étapes 2,10 à 2.13 ci-dessous. Milieu doit être entièrement remplacé trois jours après avoir été repiquées dans Transwells, puis sur un cycle alterné entre le quatrième et troisième après l&#39;alimentation précédente, jusqu&#39;à ce que les cellules sont complètement polarisées. </li><li> Chaud EMEM-10% dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Aspirer moyenne des inserts Transwell. Avec une pipette capillaire relié à un piège à vide avec un léger vide, ou à une norme de pipette de 1 ml, moyenne aspiration de puits sans cellules A1 et D1, puis ensemencé à partir des puits, enlever premier milieu apical de tous les puits, et tpoule élimination du milieu basolatéral de tous les puits. Ne pas toucher les membranes d&#39;insertion tout en aspirant à moyen terme. </li><li> Ajouter 200 ul de milieu EMEM-10% au compartiment apical de la cellule sans puits A1 et D1, puis ensemencés dans les puits, diriger le milieu dans le compartiment apical avec le côté de l&#39;insert pour guider la pointe de la pipette. Ne pas ajouter de support directement sur les cellules, et ne pas toucher la membrane d&#39;insertion. </li><li> Ajouter 600 ul de milieu EMEM-10% dans les compartiments basolatéral. Pour éviter l&#39;introduction de bulles d&#39;air dans les compartiments basolatéral, ajouter à chaque support d&#39;une pêche à la ligne par la pipette contre la paroi de chaque compartiment et le moyen de libération lente dans le puits. </li></ol> 3. Développement de la résistance de l&#39;évaluation Calu-3 LCC Mesures de sécurité: Effectuez toutes les procédures dans une enceinte de sécurité biologique en utilisant une technique de culture stérile. <ol><li> Évaluer trans-épithélial résistance électrique (TEER) de Calu-3 LCC 30 minutes aprèschangements de milieu, l&#39;évaluation peut être effectuée après chaque changement de milieu si vous le souhaitez. Effectuer des mesures dans des conditions stériles. Commencez avec des mesures de contrôle acellulaire puits A1 et D1 (les blancs) pour obtenir des mesures de référence, et continuer avec les mesures pour chaque puits. <ol><li> Dans des conditions stériles, transférer l&#39;électrode STX2 un tube à centrifuger de 50 ml contenant 70% d&#39;éthanol dans de l&#39;eau stérile, et stériliser 15 minutes. </li><li> Calibrer et tester l&#39;voltohmmeter pour une utilisation selon les instructions du fabricant. </li><li> Retirer l&#39;électrode de l&#39;éthanol, de l&#39;air sec 5-10 sec et rincer l&#39;électrode avec stérile EMEM-10%. </li><li> Réglez le commutateur de mode de la voltohmmeter au réglage de la résistance, et mettez sous tension. </li><li> Placer doucement l&#39;électrode dans l&#39;un des orifices 3 qui permettent d&#39;accéder dans le compartiment basolatéral de la culture une Transwell. Placer l&#39;électrode de telle sorte que la tête légèrement plus seulement touche le fond du puits extérieur et reste vertical,et la plus courte est de plomb dans le milieu de culture de tissu du compartiment apical, sans toucher la membrane insert. </li><li> Appuyez sur &quot;Mesure R&quot;, et attendre que la lecture se stabilise. Répéter pour les 2 autres ports pour chaque puits et enregistrer les mesures de tous les trois ports, pour un total de trois mesures par puits. Continuer à mesurer la résistance de tous les puits de cellules. </li><li> Nettoyer l&#39;électrode par trempage 5-10 min dans de l&#39;éthanol à 70%, rinçage à l&#39;O stérile dH 2, et sécher soigneusement. Stocker dans le récipient d&#39;origine. </li><li> Calculer la résistance de chacun des puits, en utilisant l&#39;équation 1. Ω = Ω réelle échantillon - Ω vide, l&#39;équation 1 où l&#39;échantillon Ω est la mesure moyenne d&#39;un puits épépiné et Ω vierge est la mesure moyenne de la 2 puits, A1 et D1, contenant des inserts et des moyens, mais pas de cellules. </li><li> Calculer la résistance unité de surface, à l&#39;aide Equation 2. Ω × réelle surface de membrane efficace = Ω × cm 2, l&#39;équation 2 où la surface de membrane efficace est de 0,33 cm 2 pour les inserts Transwell de 24 puits. </li></ol></li><li> Vérifiez que la polarisation est complète en effectuant un essai secondaire, la mesure de la diffusion passive de fluorescéine de sodium entre les compartiments apical et basolatéral, sur une à trois cultures Transwell. Les puits utilisés pour le dosage de fluorescéine de sodium doit être jetée immédiatement après la fin de l&#39;essai. <ol><li> Préparer non fluorescent tampon (118 mM NaCl; 4,75 mM de KCl; 2,53 mM de CaCl 2 .2 H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM de KH 2 PO 4; 25 mM NaHCO 3 dans de l&#39;eau stérile; filtre stérile de 0,45 um dispositif de filtration ). Préparer la fluorescéine de sodium à 1 mg / ml dans un tampon non fluorescent, filtre stérile, envelopper dans du papier aluminium, et conserver à 4 ° C, à l&#39;abri de la lumière. Réchauffer à la salle de temre avant de l&#39;utiliser. </li><li> Après avoir terminé les mesures de résistance, retirez soigneusement moyen de deux compartiments basolatéral et apical de un à trois cultures Transwell individuels. </li><li> Rincer cultures Transwell. Ajouter délicatement 600 ul de PBS à température ambiante stérile Dulbecco (D-PBS) pour les compartiments basolatéral et 100 pi température ambiante stériles D-PBS dans les compartiments apical. </li><li> Retirez délicatement D-PBS dans les puits. Ajouter 600 ul stérile non fluorescent tampon dans les compartiments basolatéral. Ajouter 100 ul stérile 1 fluorescéine sodique mg / ml dans les compartiments apicales. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant 1 heure. CO 2 n&#39;est pas nécessaire pendant cette incubation. </li><li> Pendant l&#39;incubation, préparer un sel de sodium de fluorescéine courbe standard comprise entre 20 pg / ml et 0 pg / ml, en utilisant non fluorescent tampon pour diluer la fluorescéine de sodium. Préparer au moins 8 différentes concentrations de fluorescéine de sodium, chacun dans un volume final de 600 pl au moins. Garderdilutions courbe standard abri de la lumière jusqu&#39;au moment de mesurer l&#39;absorbance. </li><li> Transférer le tampon d&#39;échantillon non fluorescent du compartiment basolatéral de chaque Transwell test pour un tube séparé propre à l&#39;analyse. Retirer le test Transwells utilisée pour examiner la diffusion passive de fluorescéine de sodium de la plaque et le jeter. Retour à la plaque Transwells restantes à l&#39;incubateur. </li><li> Placer 100 pl de chaque solution étalon en triple dans un plat à 96 puits à fond plat. </li><li> Préparer trois dilutions de chaque échantillon basolatérale (1:2, 1:20 et 1:50) dans un tampon non fluorescent, et ajouter 100 ul de chaque échantillon non dilué et de chaque dilution, en double exemplaire, dans un plat à 96 puits- plaque de fond. </li><li> Absorbance de l&#39;échantillon de mesure sur un lecteur de plaque ELISA à 486 nm ou 490 nm. </li><li> Déterminer la concentration de fluorescéine de sodium dans le compartiment basolatéral en comparant l&#39;absorbance des échantillons à l&#39;encontre des valeurs d&#39;absorbance pour la fluorescéine sodique ercourbe Andard. </li></ol></li></ol> 4. Infectant Polarized Calu-3 LCC avec le virus respiratoire Mesures de sécurité: Effectuez toutes les procédures dans une enceinte de sécurité biologique en utilisant une technique de culture stérile, à un niveau de biosécurité appropriées pour le virus utilisé. <ol><li> Diluer virus dans le sérum sans MEM afin que inoculum désiré serait dans 100 pi. </li><li> Laver les cellules dans le sérum sans MEM. Aspirer moyenne de tous les puits, enlever le milieu apical puis le milieu basolatéral. Avec une pipette capillaire relié à un piège à vide avec un léger vide, ou à une norme de pipette de 1 ml, moyenne aspiration de puits sans cellules A1 et D1, puis ensemencé à partir de puits, d&#39;une part l&#39;élimination du milieu apical de tous les puits, puis l&#39;élimination du milieu basolatéral de tous les puits. Ne pas toucher les membranes d&#39;insertion tout en aspirant à moyen terme. <ol><li> Ajouter 100 ul de sérum EMEM au compartiment apical de la cellule sans puits A1 et D1, puis à til ensemencée puits, de la direction moyenne dans le compartiment apical avec le côté de l&#39;insert pour guider la pointe de la pipette. Ne pas ajouter de support directement sur les cellules, et ne pas toucher la membrane d&#39;insertion. </li><li> Ajouter 600 ul de sérum EMEM aux compartiments basolatéral. Ajouter à chaque milieu Transwell en inclinant la pipette contre la paroi du compartiment à libération lente et le milieu dans le puits. </li><li> Aspirer un milieu sans sérum à partir de puits. </li></ol></li><li> A partir de puits non infectées ou infectées maquette, ajouter dilutions de virus appropriées pour le compartiment apical de Transwells. Pour les puits non infectés, ajouter 100 ul de sérum sans MEM dans le compartiment apical de Transwells appropriées, par pseudo-infectées puits, ajouter 100 ul de virus sans préparation dilué dans du sérum sans MEM dans le compartiment apical de Transwells appropriées, et pour infection par le virus, diluer le virus dans le sérum sans MEM et ajouter 100 ul dans les compartiments apical de Transwells appropriées. </li><li>Ajouter 600 ul de sérum EMEM à tous les compartiments basolatéral. </li><li> Incuber à 37 ° C et 7% de CO 2 pendant 2 heures. </li><li> Aspirer moyen de puits, d&#39;abord à partir de puits non infectés et infectés par simulation, puis à partir de puits infectés. Retirer surnageants apicaux d&#39;abord, puis les surnageants basolatéral. </li><li> Remplacer moyenne avec 200 pl de milieu EMEM-10% dans les compartiments apical et 600 ul de milieu EMEM-10% dans les compartiments basolatéral. </li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+culture+conditions+to+develop+an+in+vitro+pulmonary+permeability+model.">Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).</li><li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier.">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Lors de l&#39;établissement Calu-3 dans des inserts Transwell LCC, les cellules ne peuvent pas du tout polariser, ou peuvent ne pas être totalement polariser, telle que définie par un TEER ≥ 1000 Ω x cm 2 et ≤ 1% de sodium de fluorescéine colorant équilibrage entre les compartiments basolatéral et apical. En outre, les cellules Calu-3 dans LCC peut polariser entièrement, mais TEER peuvent être incompatibles entre les mesures. Bien que les fluctuations dans les mesures de TEER de cellules Calu-3 LCC sont normales au jour le jour, une fois complètement polarisées, balançoires dramatiques dans TEER sont pas attendus avant la culture diminue naturellement avec l&#39;âge, ce qui peut être aussi peu que 5 semaines ou aussi longtemps que 12 semaines après le semis. La capacité des cellules Calu-3 LCC à polariser dépend en partie de la façon dont les cellules sont maintenues et repiqués avant de l&#39;utiliser dans le système Transwell. Les cellules qui se sont développées au-delà de 90% de confluence en monocouche pendant le repiquage, qui ont été repiquées plus de 10 fois en stock congelé, ou qui n&#39;ont pas êtrefr fourni avec un milieu frais sur une base régulière sont moins susceptibles de polariser entièrement, et toute polarisation est susceptible de diminuer rapidement. Manque incomplète ou totale de la polarisation peut également être attribuée à la variation dans le matériau et la taille des pores de Transwells utilisés pour Calu-3 LCC, et beaucoup à beaucoup de variation dans Transwells de composition similaire et la taille des pores peut également affecter la polarisation. Tailles de pores plus grands peuvent permettre Calu-3 à grandir à travers la membrane Transwell dans le compartiment basolatéral, ce qui empêche la culture de polarisation. Une absence de polarisation peut également être due à la croissance bactérienne, indiqué par un milieu de culture nébuleuse, ce qui conduit à la dégradation ultérieure des jonctions serrées entre les cellules Calu-3. Mesures de TEER variables de Calu-3 LCC peuvent être causées par des perturbations mécaniques des monocouches de cellules Calu-3 LCC, les inserts ou les plaques elles-mêmes. Changements de milieu et des mesures de TEER devraient être exécutées sans pointes de pipettes ou électroconduit de toucher les cellules. Lors de l&#39;exécution de ces opérations, des précautions doivent être prises pour éviter l&#39;introduction de bulles d&#39;air dans les compartiments apical et basolatéral, qui vont perturber la capacité du voltohmmeter pour détecter la résistance. La capacité de la voltohmmeter pour détecter la résistance dans une culture qui est en réalité polarisée peut également limitée par l&#39;accumulation de protéines sur les fils d&#39;électrodes. Cette accumulation peut être enlevé avec ponçage léger, ou peut être corrigé par le remplacement de l&#39;électrode. Une fois Calu-3 LCC complètement polariser et la TEER n&#39;augmente plus, Calu-3 LCC sont prêts à être utilisés comme un modèle in vitro pour caractériser les réponses d&#39;accueil de cellules épithéliales pulmonaires aux infections respiratoires. Ce système permet une meilleure caractérisation des réponses directionnelles à des agents pathogènes par rapport à une monocouche de culture des lignées de cellules pulmonaires traditionnellement utilisées pour étudier les pathogènes respiratoires, comme l&#39;A549 et cellules HEp-2, avec les avantages supplémentaires de Calu-3 bei LCCng plus rapide à développer, plus facile à obtenir, et moins cher à produire que l&#39;enseignement primaire, polarisé, NHBE différenciée. Semblable à NHBE, polarisée Calu-3 montrent la formation des jonctions serrées, et de produire des mucines. Cependant, contrairement à NHBE, polarisés Calu-3 cellules ne se différencient pas en couches de cellules basales et les cellules épithéliales ciliées, et quelques polarisés Calu-3 cellules se développent cils projections semblables 19. Ainsi, bien utile pour examiner les réponses des cellules polarisées épithéliales des voies aériennes respiratoires à l&#39;insulte, polarisée Calu-3 LCC ne sont pas un modèle idéal pour étudier le développement des voies aériennes ou de rénovation en réponse à une agression respiratoires ou des blessures. La production de mucus par les cellules en culture in vitro peut avoir un impact infectivité cellulaire, ainsi que la libération de virus infectieux et la propagation du virus dans un modèle polarisé, et une comparaison directe de la production de mucus entre polarisée Calu-3 LCC et polarisée, NHBE différencié n&#39;a pas été signalée . A549 et cellules HEp-2 d&#39;unesont plus faciles à la culture de cellules Calu-3, mais, contrairement à Calu-3 LCC, ils ne forment pas cultures polarisées lorsqu&#39;elles sont cultivées sur des inserts Transwell, et sont des modèles idéaux donc pas d&#39;examiner in vitro les réponses des cellules épithéliales polarisées à l&#39;infection par le virus respiratoire .

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REACTIFS </td></tr><tr><td> Calu-3 </td><td> ATCC </td><td> HTB-55 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de trypsine - EDTA à 0,02% </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Eagle milieu essentiel minimum (MEM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 07-00100DK </td><td></td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> Chaleur inactiver, 56 ° C, 30 min </td></tr><tr><td> Non-acides aminés essentiels 100X (10 mM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11140 </td><td> Conserver à 4 ° C dans l&#39;obscurité </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> FBS EMEM-10% (EMEM-10%) </td><td></td><td></td><td> Supplément EMEM avec la chaleur de FBS inactivé à 10% de sérum stérile filtre </td></tr><tr><td> EMEM-20% de FBS + suppléments (EMEM-20% + S) </td><td></td><td></td><td> Supplément EMEM à des concentrations finales: inactivé par la chaleur FBS, 20%; 1X acides aminés; 2 mM de L-glutamine; HEPES 10 mM, stérile filtre </td></tr><tr><td> Plaques à 24 puits Transwell </td><td> Corning Costar </td><td> 3472 </td><td> 3 taille des pores um, polyester </td></tr><tr><td> Bleu trypan </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15250 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éthanol </td><td> Sigma </td><td> E7023 </td><td> Préparez-vous à 70% en utilisant stérile dH 2 O </td></tr><tr><td> PBS de Dulbecco (D-PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> Non fluorescent tampon </td><td></td><td></td><td> 118 mM NaCl;4,75 mM de KCl; 2,53 mM de CaCl 2 x H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM de KH 2 PO 4; 25 mM NaHCO 3 dans de l&#39;eau stérile; stérile-filtre </td></tr><tr><td> Fluorescéine de sodium </td><td> Sigma </td><td> 6377 </td><td> 1 mg / ml dans des conditions stériles non fluorescent tampon; stérile filtre, protéger de la lumière, conserver à 4 ° C à 6 mois </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ÉQUIPEMENT </td></tr><tr><td> Voltohmmeter </td><td> World Precision Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> STX2 électrode </td><td> World Precision Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lecteur de plaque ELISA </td><td></td><td></td><td> Capable de mesurer A 486 ou A 490 </td></tr></tbody></table>

establishing a liquid-covered culture of polarized human airway epithelial calu-3 cells to study host cell response to respiratory pathogens in vitro

Les surfaces apicales et basolatérale des cellules épithéliales des voies aériennes démontrer réponses directionnelles à l&#39;exposition pathogène in vivo. Ainsi, idéal dans des modèles in vitro pour examiner les réponses cellulaires à des agents pathogènes respiratoires polarisent, formant des surfaces apical et basolatéral. Un tel modèle se différencie normales cellules épithéliales bronchiques humaines (NHBE). Cependant, ce système nécessite des échantillons de tissus pulmonaires, l&#39;expertise isoler et cultiver des cellules épithéliales du tissu, et le temps pour générer une culture de l&#39;interface air-liquide. Calu-3 cellules, dérivées d&#39;un adénocarcinome bronchique humain, sont un modèle alternatif pour l&#39;examen de la réponse des cellules des voies respiratoires proximales épithéliales respiratoires insulte 1, composés pharmacologiques 2-6, et 7-9 bactérienne et des agents pathogènes viraux, y compris les virus de la grippe, rhinovirus et le syndrome respiratoire aigu sévère - le coronavirus associé au 10-14. Récemment, we démontré que Calu-3 cellules sont sensibles au virus respiratoire syncytial (VRS) d&#39;une manière compatible avec NHBE 15,16. Ici, nous détaillons la mise en place d&#39;un polarisée, liquide recouvert de culture (LCC) des cellules Calu-3, en se concentrant sur les détails techniques de culture et de la culture de cellules Calu-3, le maintien des cellules qui ont été cultivées dans LCC, et nous présentons le procédé pour effectuer infection par le virus respiratoire polarisés cellules Calu-3. Pour obtenir systématiquement polarisée Calu-3 LCC, les cellules Calu-3 doit être soigneusement repiquées avant la culture dans les inserts Transwell. Calu-3 cultures monocouches devrait rester inférieur à 90% de confluence, doivent être repiquées moins de 10 fois en stock congelé, et doit être régulièrement alimenté par du milieu frais. Une fois cultivées dans Transwells, Calu-3 LCC doivent être manipulés avec soin. Irréguliers changements de supports et de la perturbation mécanique ou physique des couches de cellules ou de plaques de polarisation pour avoir un impact négatifplusieurs heures ou jours. Polarisation est contrôlée par l&#39;évaluation de trans-épithéliale résistance électrique (TEER) et est contrôlée par l&#39;évaluation de l&#39;équilibrage passif de la fluorescéine de sodium entre les compartiments basolatéral et apical 17,18. Une fois les plateaux TEER égale ou supérieure à 1000 Ω x cm 2, Calu-3 LCC sont prêts à utiliser pour examiner les réponses cellulaires à des agents pathogènes respiratoires.

Lorsqu&#39;il est cultivé comme liquide recouvertes de cultures (CLC) dans les systèmes de culture Transwell, comme illustré à la figure 1, les cellules Calu-3, polarisent développement distincts surfaces apical et basolatéral. Suivant la méthode décrite ici, la résistance électrique trans-épithéliale (TEER) de Calu-3 LCC atteint un plateau ou supérieure à 1000 Ω × cm 2 dans les 3 semaines après le semis, dont un exemple est illustré à la figure 2. Les jonctions serrées formées entre cellules polarisées empêcher l&#39;équilibrage passif de petites molécules entre les compartiments apical et basolatéral. Ainsi, un test de la fluorescéine de sodium modifié l&#39;équilibre est utilisée pour confirmer la polarisation de Calu-3 LCC 15.17.18. Que la TEER de monocouches de cellules Calu-3 augmente dans LCC, la quantité de fluorescéine qui s&#39;équilibre passivement dans le compartiment basolatéral diminue. Une fois la TEER est 1.000 Ω x cm 2, la quantité de fluorescéine qui s&#39;équilibre endans le compartiment basolatéral est ≤ 1%, comme le montre la figure 3, par conséquent, Calu-3 LCC sont considérés comme complètement polarisée lorsque la TEER est ≥ 1000 Ω x cm 2. La mesure de TEER pic de Calu-3 LCC peut varier d&#39;une expérience à l&#39;. Cependant, une fois les valeurs TEER plateau pour une expérience donnée, un complètement polarisée, non infecté Calu-3 LCC peut être stable pendant 5 à 12 semaines après l&#39;ensemencement. Absence de développement d&#39;une résistance dans Transwell-culture Calu-3 peut être causée par plusieurs facteurs tels que décrits dans le tableau 1. Lorsque le TEER de Calu-3 plateaux LCC ou au-dessus de 1000 × Ω cm 2, le modèle est prêt à être utilisé pour examiner réponses des voies aériennes de cellules épithéliales respiratoires à des agents pathogènes, notamment les virus respiratoire syncytial (VRS). L&#39;exposition à des résultats RSV dans une baisse plus rapide de la culture de l&#39;intégrité polarisée par rapport à une maquette de l&#39;infection des cellules (figure 4). Figure 1. Les cellules section représentation des Transwell-cultures de cellules. Sont cultivées sur la surface apicale de la membrane d&#39;insertion. <img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" /> Figure 2. Développement des réseaux trans-épithélial résistance électrique (TEER) et la polarisation des cellules Calu-3 après le semis dans des inserts Transwell. A chaque point dans le temps, TEER est présentée comme médiane cm x 2 Ω ± SEM de 32 puits indépendants issus d&#39;une expérience représentative. <img alt="Figure 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" /> Figure 3. Passif equilibre<html> bration de la fluorescéine de sodium dans le compartiment basolatéral des monocouches de cellules Calu-3 est inhibée que les cellules se polariser. données cumulées de quatre expériences indépendantes sont présentés. Chaque point représente une mesure individuelle. <img alt="Figure 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" /> Figure 4. Infection par le VRS de polarisation Calu-3 LCC accélère une baisse intégrité de la monocouche. Polarized Calu-3 cellules ont été infectées avec RSV-A2 à une MOI = 1 au jour 0 et la polarité a été suivie pendant 8 semaines après l&#39;infection. Une expérience représentative est présentée. Les données sont présentées comme la résistance médiane de 8 puits indépendants par l&#39;infection ± SEM par point de temps. * P &lt;0,05 entre les cultures maquette et RSV-A2-infectés, tels que déterminés par t de Student-test. moyens &quot;&gt; <tbody><tr><td> Question </td><td> Résolution (s) </td></tr><tr><td> La résistance n&#39;est pas mesurable </td><td><ul><li> Retirer les bulles d&#39;air dans les puits </li><li> Utilisez Calu-3 cellules qui ont été repiquées en stock congelé moins de 10 fois </li><li> Ne laissez pas les cellules Calu-3 pour atteindre 100% de confluence dans la sous-culture monocouche </li><li> Vérifier que les cellules ne poussent pas sur le plastique bien en dessous de la garniture (ce qui indique que les cellules peuvent avoir poussé à travers les pores de l&#39;insert) </li><li> Permettez 2-3 semaines après l&#39;ensemencement pour le développement résistance complète </li><li> Vérifiez la composition et la taille des pores d&#39;inserts utilisés, changer si nécessaire (insert polyester recommandé, 0,3 um taille des pores, pas de revêtements, matériaux pour voir les détails) </li><li> Vérifier la qualité de l&#39;électrode, le ponçage doucement pour éliminer les protéines accumulées à partir de la pointe, et le remplacement, si nécessaire </li><li> Vérifiez milieu pour la croissance bactérienne </li></ul&gt; </td></tr><tr><td> La résistance se développe, mais la polarisation complète (≥ 1000 Ω x cm 2) n&#39;est pas atteint </td><td><ul><li> Prévoyez un délai supplémentaire pour la polarisation de se développer (peut parfois prendre jusqu&#39;à 4 semaines) </li><li> Utilisez Calu-3 cellules qui ont été repiquées en stock congelé moins de 10 fois </li><li> Ne laissez pas les cellules Calu-3 pour atteindre 100% de confluence dans la sous-culture monocouche </li><li> Constamment remplacer les moyennes dans les cultures Transwell, alternant entre le troisième jour, puis la quatrième place après l&#39;alimentation précédente </li><li> Seules des cellules en culture sur des inserts qui sont placés dans les rangées extérieures des plaques </li><li> Utilisez un lot différent d&#39;inserts Transwell </li></ul></td></tr><tr><td> Polariser les cellules complètement, mais la résistance n&#39;est pas uniforme d&#39;une lecture à l&#39;autre </td><td><ul><li> Ne pas perturber ou empiler des plaques dans l&#39;incubateur </li><li> Ne pas provoquer des vibrations dans l&#39;armoire de biosécurité en Transwell platees sont traitées </li><li> Retirer les bulles d&#39;air dans les puits </li><li> Ne pas déranger la couche de cellules avec des pointes de pipette lors du changement de média ou d&#39;effectuer des lectures TEER </li><li> Utiliser 200 pl de milieu dans le compartiment apical; baisse du volume peut entraîner des lectures instables TEER </li><li> Vérifiez la qualité de l&#39;électrode, le ponçage en douceur pour éliminer les protéines accumulées à partir de la pointe, et remplacer si nécessaire </li></ul></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Identifier des problèmes qui peuvent survenir lorsque la culture de cellules Calu-3 dans Transwells. De multiples facteurs contribuent à la polarisation complète de cellules Calu-3 dans le liquide recouvertes de cultures, les plus susceptibles de laquelle sont mis en évidence dans ce tableau.

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Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Les constatations et conclusions présentées dans ce rapport sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues des Centers for Disease Control and Prevention.

L&#39;établissement d&#39;une culture liquide recouvert de Airway humaines épithéliales polarisées cellules Calu-3 pour étudier la réponse cellulaire aux agents pathogènes respiratoires hôte<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

establishing-liquid-covered-culture-polarized-human-airway-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

22.3K vues.  Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Les constatations et conclusions présentées dans ce rapport sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues des Centers for Disease Control and Prevention.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-culture des modèles Pseudomonas aeruginosa Les biofilms Cultivé sur le Live cellules des voies respiratoires de l&#39;homme

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Recherche

Immunologie et infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Application d&#39;une souris ligaturés Assay Peyer Patch anse intestinale pour évaluer absorption par les cellules bactériennes M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Une<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour étudier l&#39;hétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Cultures placentaire et déciduale organe humain pour l&#39;étude des infections à l&#39;interface materno-fœtale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Le développement d&#39;un anticorps salivaire Multiplex Immunoassay mesurer l&#39;exposition humaine aux agents pathogènes environnementaux

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

La surexpression et la purification de l&#39;être humain<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransférase dans<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Un nouveau système exempt d’alimentation pour la Production de masse des cellules tueuses naturelles murins In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and migration. One critical limitation of such assays, however, is their homogenous assortment of cellular types. Repair is a complex process which demands the interaction of several cell types. Therefore, to study a culture devoid of cellular subtypes, is a concern that must be overcome if we are to understand the repair process. The gastric organoid model may alleviate this issue whereby the heterogeneous collection of cell types closely reflects that of the gastric epithelium or other native tissues in vivo. Demonstrated here is a novel, in vitro scratch-wound assay derived from human or mouse 3-dimensional organoids which can then be transferred to a gastric epithelial monolayer as either intact organoids or as a single cell suspension of dissociated organoids. The goal of the protocol is to establish organoid-derived gastric epithelial monolayers that can be used in a novel scratch-wound assay system to study gastric regeneration.

Here we describe a protocol for establishing and culturing human- and mouse-derived 3-dimensional (3D) gastric organoids, and the method for the transfer of 3D organoids to a 2-dimensional monolayer. The use of the gastric epithelial monolayer as a novel scratch-wound assay for regeneration studies is also described.

Souris - et anthropique de Culture monocouche épithéliales gastriques primaire pour l’étude de la régénération

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monocouches de Colonoid humain pour étudier les Interactions entre les pathogènes, germes commensaux et hôte épithélium Intestinal

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...