Ce travail a été soutenu par le Bureau de la recherche et du développement, RR &amp; D services, ministère américain des Anciens combattants, NIH COBRE 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 et le ministère de la Défense W81XWH-10-1-0643.

1. Biaxiale Chargement bioréacteur Conception <ol><li> Le bioréacteur emploie deux étapes fabriqués par Thor-labs (Newton, MA) pour les applications laser à guidage de précision pour appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale de tissus fabriqués avec une grande précision de la dose de charge (amplitude et fréquence) et l&#39;application d&#39;un large éventail de conditions de culture de tissus de simple à plaques à 24 puits (Figure 1). </li><li> Chargement bi-axial est réalisé en deux étapes travelmax (LNR50SE). Ces étages sont montées orthogonalement dans une configuration XZ. La phase horizontale fournit des mouvements de cisaillement dynamiques en oscillant le long de l&#39;axe des X. La phase verticale fournit une charge de compression dynamique en faisant osciller le long de l&#39;axe Z. Ces étapes ont une gamme de voyage de 50 mm et sont entraînés indépendamment par stepper actionneurs à moteur (DRV014), commandé par un pilote de moteur pas à pas en boucle fermée (BSC102) qui offre des capacités de Micro-progression, ce qui permet des tailles de pas de moins de50 nm. </li><li> Le dispositif est monté sur un support rigide 25 cm x 30 cm x 12,5 plaque de base en aluminium de mm qui est utilisé en tant que plate-forme pour le montage de composants de la machine et pour le montage de plaques de culture de tissus. Butées réglables cinématiques sont utilisés pour verrouiller les plaques de culture de tissus en place sur la plaque de base en aluminium. Ces arrêts cinématiques ont des vis de réglage fin pour permettre un alignement précis qui est par ailleurs pas réalisable à la main. La conception modulaire de la plaque de base permet un placement souple de ces arrêts cinématiques pour accueillir des plaques de différentes tailles et formes (boîtes de Petri par rapport aux plaques multi-puits). </li><li> Une coutume-usiné polysulfone chargement plaque est couplée à la plate-forme mobile bi-axial via un usinage de précision crochet droit. Matériau polysulfone a été choisi en raison de sa biocompatibilité, une facilité d&#39;usinage, et la facilité de stérilisation. </li><li> Mouvements des étapes sont contrôlées par la technologie de positionnement avancé Thor-laboratoires d&#39;(APT) du logiciel. Le moteur pas à pas, c&#39;est noused en association avec le logiciel qui permet l&#39;ajustement de paramètres de charge de fréquence et d&#39;amplitude à la fois de cisaillement et de compression indépendante et simultanée. </li><li> Rétroaction de position est fournie par des codeurs optiques linéaires qui sont attachés à chaque plate-forme mobile et sont intégrés au logiciel. Le système de codeur a une répétabilité bidirectionnelle de 0,1 um et une résolution de 20 nm, traduisant une précision de positionnement inférieure à 3 um sur la totalité de 50 mm de course. Ces codeurs fournissent la rétroaction de position nécessaire à l&#39;électronique de commande pour assurer une véritable capacité de nanopositionnement et une lecture directe de la position absolue. </li><li> Afin d&#39;assurer le retour de force nécessaire pour détecter un contact entre plateau et des échantillons et évaluer les réponses de chargement, une cellule de charge miniature de précision (Honeywell Modèle 31) est positionné entre le chargement d&#39;impression et la plate-forme mobile (Figure 2). La cellule de charge a une précision élevées de0,15% à 0,25% de la pleine échelle. L&#39;unité d&#39;affichage (SC500) pour la cellule de charge peut également fournir des mesures de charge allant jusqu&#39;à 5 décimales. En outre, il dispose d&#39;un port RS-232 pour permettre la collecte de données sur un ordinateur. </li></ol> 2. Cell-ensemencées Agarose constructions <ol><li> Préparer 4% d&#39;agarose: Ajouter 0,8 g d&#39;agarose à 20 ml de DMEM (sans additifs) dans un flacon de 50 ml, faire bouillir, puis garder à 70 ° C four jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Ajuster le volume de la suspension cellulaire de la double quantité de la densité d&#39;ensemencement des cellules désirée. Cette suspension est mélangée à volume égal de 4% p / v d&#39;agarose pour créer un gel d&#39;agarose à 2% à la densité de semis voulue. </li><li> Placez la fois la suspension cellulaire et une pipette de 10 ml dans l&#39;incubateur. </li><li> Mettre en place le système de coulée de gel. Une 1,5 mm et une plaque d&#39;espacement de 0,75 mm devrait être mis ensemble pour créer un gel d&#39;une épaisseur de 2,25 mm. D&#39;autres plaques d&#39;écartement de taille peuvent être utilisés pour créer un gel d&#39;épaisseurs différentes. Le système de coulée de gel n&#39;est pas suffisamment grand pour contenir ces plaques togetelle, alors ils doivent être scellés en toute sécurité pour éviter les fuites. </li><li> L&#39;étape suivante consiste à mélanger rapidement la suspension de cellules avec de l&#39;agarose et la pipette préparée précédemment dans le moule de gel avant que l&#39;agarose se solidifie. Retirez le agarose liquide du four et placez un thermomètre stérile en elle. La gélose doit refroidir à 42-43 ° C avant de les mélanger avec les cellules. Réchauffer la suspension de cellules à 37 ° C. Une fois que l&#39;agarose frappe 43 ° C, une pipette rapidement la quantité désirée puis pipette immédiatement la suspension de cellules de haut en bas plusieurs fois pour mélanger. Puis ajouter immédiatement la totalité du mélange dans le moule de gel. </li><li> Laisser le gel se solidifier pendant 10-15 minutes, puis inclinez-le soigneusement à l&#39;horizontale. </li><li> Retirer la plaque de verre supérieure et disques de punch avec la biopsie. Les disques peuvent être ramassés avec une petite spatule stérile. Dans notre expérience, un ml de gel 9 est assez grand pour faire plus d&#39;une centaine de disques de 5 mm de diamètre. </li></ol> 3. Culture des disques </p&gt; <ol><li> Placer un disque dans chaque puits d&#39;une plaque de culture non-tissulaire 24 ainsi traitée. </li><li> Ajouter 2 ml de milieu de différenciation chondrocytaire sans sérum à chaque puits. </li><li> Mettez les plaques dans l&#39;incubateur (37 ° C, 5% de CO 2). </li><li> Pour les changements de supports, remplacer 1 ml par puits tous les 2-3 jours. </li></ol> 4. Immobilisation des échantillons pour Chargement mécanique <ol><li> Préparer 4% d&#39;agarose (pas de suspension cellulaire ajoutée) et le gel doit être plus mince que les échantillons eux-mêmes (pour éviter les interférences pendant le chargement). L&#39;épaisseur recommandée est de 1,5-1,9 mm (pour les échantillons de 2,25 mm d&#39;épaisseur). </li><li> Une fois gélifiées, les disques d&#39;un diamètre de 16 mm poinçon pour plaques à 24 puits. Dans chaque disque, un trou de poinçon de 5 mm de l&#39;échantillon à être placé in Si on le souhaite, un autre trou de poinçon de 5 mm sur le bord du disque à la pipette pour être placé lors de changements de supports. </li><li> Une fois que les puits d&#39;agarose ont été faites, place dans 24 plaques à puits, comme le montre la figure 3. </li><li> Une fois le w agaroseElls sont en plaque de 24 puits, Press Fit échantillons dans chaque puits. L&#39;échantillon ne doit faire saillie à partir de la partie supérieure du puits d&#39;agarose. </li></ol> 5. Chargement mécanique <ol><li> Stériliser plateau (Figure 2). </li><li> Fixer la plaque d&#39;aluminium pour charger la cellule. Sécurisé platine / cellule / aluminium ensemble de plaque de charge à l&#39;étage de charge. </li><li> Allumez le contrôleur de moteur pas à pas (interrupteur à l&#39;arrière). </li><li> Allumez le programme ouvert &quot;APT utilisateur&quot; (Figure 4) et PC. <ol><li> Écran gauche contrôle moteur pas à pas horizontal. Écran droite contrôle moteur pas à pas vertical. Dans chaque écran, onglet &quot;graphique de configuration» permet un positionnement manuel et onglet &quot;Sequencer Move&quot; permet l&#39;automatisation. Toutes les unités sont mm. </li></ol></li><li> Allez à l&#39;onglet &quot;Contrôle graphique&quot; sur les deux écrans et appuyez sur le bouton &quot;Home / Zero&quot;. Les deux moteurs pas à pas ont une portée de 50 mm. Appuyez sur &quot;Accueil / Zero&quot; enverra deux moteurs pas à pas à la position zéro (haut et à droite la plupart des postes). </li><li> Prepare les échantillons dans la plaque de 24 puits pour le chargement en supprimant certains médias de chaque puits. Pas plus de 1 ml de milieu doit être laissé dans chaque puits pour éviter tout débordement lors du chargement. Assurez-vous que suffisamment de médias sont laissés dans le puits pour maintenir l&#39;échantillon couvert. <ol><li> Notez que l&#39;incubateur est conservé dans des conditions de faible humidité pour éviter une défaillance de l&#39;appareil. </li></ol></li><li> Placer la plaque 24 puits en bioréacteur et aligner soigneusement avec la platine. <ol><li> La plaque est fixée à l&#39;aide de quatre bioréacteur localisateurs cinématiques réglables. Pour rendre plus facile pour aligner le plateau, les deux locators gauche ont été pré-positionnés. Serrez les deux locators droite de sorte que la plaque est sécurisée. Assurez-vous d&#39;aligner la plaque parfaitement sur le devant de la base du bioréacteur. </li><li> Dans l&#39;onglet &quot;Contrôle graphique&quot;, une position moteur pas à pas spécifique peut être saisie manuellement en cliquant sur la case de position. Utilisez cette fonction pour réduire lentement le plateau et le déplacer horizontalement afin de s&#39;aligner avec la plaque. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Une fois que le plateau est proche d&#39;entrer en contact avec des échantillons, commencer à mettre la platine vers le bas par incréments très lentes (0,1 mm) jusqu&#39;à ce que vous atteignez la position de départ prédéterminée (voir partie 6). </li><li> Une fois la position de départ est atteint, allez dans &quot;Déplacer Sequencer&quot; onglet et charger la séquence de déplacement souhaitée en appuyant sur &quot;Load&quot;. Ensuite, appuyez sur &quot;Exécuter&quot; pour commencer. (Figure 5) Voir la partie 7. Rédaction d&#39;un protocole de dosage. </li><li> Lorsque vous avez terminé le chargement, le soulever manuellement le plateau. Si les échantillons sont collés sur la vitre d&#39;exposition, soigneusement mis de nouveau dans le puits approprié à l&#39;aide d&#39;une spatule stérile. </li><li> Retirer la plaque 24 et de bioréacteur et de remplacer les médias. </li><li> Retirez délicatement le plateau de la cellule de charge, puis s&#39;éteint instruments. </li></ol> 6. Calibrage Chargement Platen Pour s&#39;assurer que les souches appropriées sont appliquées aux échantillons, chaque plateau doit être soigneusement calibrée avant de commencer une expérience. <ol><li&gt; Effectuer les étapes 5.1 et 5.8. </li><li> Mettre manuellement moteur pas à pas de la position horizontale à 25 mm. </li><li> Platine inférieure avec précaution jusqu&#39;à ce qu&#39;elle arrive juste à peine en contact avec le fond du bioréacteur. Cellule de charge indique l&#39;augmentation des charges à ce point. Prenez note de la position exacte du moteur pas à pas vertical (être aussi précis que possible, que toutes les mesures de contrainte de compression seront calculés à partir de cette valeur). </li><li> Enregistrer la position. Cette valeur sera utilisée pour écrire un protocole de dosage en fonction des dimensions de l&#39;échantillon et les contraintes désirées. </li></ol> 7. Rédaction d&#39;un protocole de dosage <ol><li> Le bioréacteur est capable d&#39;appliquer des contraintes à la fois en compression et en cisaillement, que ce soit simultanément ou individuellement. Trois paramètres principaux doivent être décidées: tare contrainte de compression, amplitude de la déformation dynamique, et la fréquence de chargement. </li><li> Une souche de tare est appliquée afin d&#39;empêcher le décollage de la platine à partir de l&#39;échantillon. </li><li> Exemple amplitude de la déformation dynamique et chargement frequence sont choisis. </li></ol> Dans cette étude, nous définissons une contrainte de compression et de cisaillement comme suit: <img alt="Équation 1" fo:content-width="3.26in" fo:src="/files/ftp_upload/50387/50387eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50387/50387eq1.jpg" /> Exemple protocole de dosage bi-axial épaisseur de l&#39;échantillon: 2,25 mm Tare Strain (Compression): 10% de l&#39;épaisseur de l&#39;échantillon (0,225 mm) Amplitude de déformation dynamique (compression): 10% (+ / - 5% de l&#39;épaisseur de l&#39;échantillon) Fréquence (Compression): 1 Hz L&#39;amplitude de déformation dynamique (cisaillement): 25% de l&#39;épaisseur de l&#39;échantillon (0,5625 mm): La contrainte de cisaillement est appliquée à l&#39;échantillon par le cylindre d&#39;impression se déplaçant horizontalement. Fréquence (cisaillement): 0,5 Hz Protocole de dosage typique est de 3 h de chargement par jour. Dans cet exemple, le chargement dynamique et de cisaillement est appliquée simultanément plutôt que séquentiellement. Nous croyons mieux ce modèle mimics l&#39;environnement de chargement complexe dans le genou humain. <ol start="4"><li> Une fois le protocole de dosage a été sélectionné, un programme de séquence de déplacement de compression doit être écrit. </li><li> La séquence de mouvement est exactement ce que cela ressemble, une liste des positions que le moteur pas à pas se déplace à une accélération spécifié et la vitesse maximale. </li><li> Calculez des positions verticales souhaitées en fonction de dosage protocole et la valeur d&#39;étalonnage plateau (de la partie 6). </li><li> Exemple calculs pour Platen 1 sont fournis ci-dessous: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Différence de valeur d&#39;étalonnage </td><td> Position verticale </td></tr><tr><td> Platen valeur d&#39;étalonnage (touche bas du bioréacteur) </td><td> 0 mm </td><td> 29,7700 mm </td></tr><tr><td> Platen en contact avec l&#39;échantillon (échantillon de 2,25 mm) </td><td> 4,4140 mm </td><td> 25,3560 mm </td></tr><tr><td> Stpluie (5% Epaisseur) </td><td> 4,3015 mm </td><td> 25,4705 mm </td></tr><tr><td> Strain (10% Epaisseur) </td><td> 4,1890 mm </td><td> 25,5810 mm </td></tr><tr><td> Strain (15% Epaisseur) </td><td> 4,0765 mm </td><td> 25,6955 mm </td></tr></tbody></table><ol start="8"><li> Une fois que les positions sont calculées, d&#39;expérimenter avec l&#39;accélération et les valeurs maximales de vitesse pour obtenir la bonne fréquence. Le nombre de cycles doit être choisi en conséquence (par exemple 10.800 cycles de 3 h à 1 Hz). </li><li> Exemple de programme dynamique de compression de mouvement de la séquence (10% de tare compression, 10% de l&#39;amplitude de la contrainte dynamique, 1 Hz) (Figure 5) </li><li> Programme de séquence de déplacement de cisaillement dynamique: Le nombre de cycles doit être choisie en fonction de la fréquence et de la durée souhaitée (par exemple 5.400 cycles pendant 3 heures à 0,5 Hz). </li><li> Exemple de programme dynamique de cisaillement de la séquence de déplacement (10% de compression de tare, 0,5625 mm (25% de l&#39;épaisseur) de l&#39;amplitude de la déformation de cisaillement dynamique, 0,5Hz) (Figure 5). </li></ol>

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	<li>Drachman, D. B., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+movement+in+embryonic+joint+development.">The role of movement in embryonic joint development.</a> Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).</li><li>Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+compression+modulates+matrix+biosynthesis+in+chondrocyte/agarose+culture.">Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture.</a> J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).</li><li>Vunjak-Novakovic, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+Cultivation+Conditions+Modulate+the+Composition+and+Mechanical+Properties+of+Tissue-Engineered+Cartilage.">Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).</li><li>Gooch, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Mixing+Intensity+on+Tissue-Engineered+Cartilage.">Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage.</a> Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).</li><li>Carver, S. E., Heath, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+extracellular+matrix+production+in+regenerating+cartilage+with+intermittent+physiological+pressure.">Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure.</a> Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).</li><li>Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+shear+and+compression+apparatus+for+mechanical+stimulation+of+tissue+culture+explants.">A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants.</a> J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).</li><li>Wagner, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrostatic+pressure+enhances+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells+in+osteochondrogenic+medium.">Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium.</a> Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).</li><li>Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Tissue+Engineering:+The+Role+of+Biomechanics.">Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics.</a> J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).</li><li>Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Tissue+Engineering.+The+role+of+biomechanics+in+articular+cartilage+repair.">Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair.</a> Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).</li><li>Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cartilaginous+ECM+gene+transcription+by+chondrocytes+and+MSCs+in+3D+culture+in+response+to+dynamic+loading.">Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading.</a> Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).</li><li>Rubin, C., Xu, G., Judex, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anabolic+activity+of+bone+tissue,+suppressed+by+disuse,+is+normalized+by+brief+exposure+to+extremely+low-magnitude+mechanical+stimuli.">The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli.</a> FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).</li><li>Wimmer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribology+approach+to+the+engineering+and+study+of+articular+cartilage.">Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage.</a> Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).</li><li>Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cartilaginous+matrix+accumulation+on+viscoelastic+response+of+chondrocyte/agarose+constructs+under+dynamic+compressive+and+shear+loading.">Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading.</a> J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).</li><li>Heiner, A. D., Martin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+responses+to+a+novel+triaxial+mechanostimulatory+culture+system.">Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system.</a> J. Biomech. 37, 689-695 (2004).</li><li>Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-axial+mechanical+stimulation+of+tissue+engineered+cartilage:+review.">Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review.</a> Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).</li><li>Wartella, K. A., Wayne, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+for+biaxial+mechanical+stimulation+to+tissue+engineered+constructs.">Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs.</a> J. Biomech. Eng. 131, 044501 (2009).</li><li>Bian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+loading+enhances+functional+properties+of+tissue-engineered+cartilage+using+mature+canine+chondrocytes.">Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).</li><li>Bilgen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+Biaxial+Loading+Device+for+Cartilage+Tissue+Engineering.">Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering.</a> , 1815 (2011).</li><li>Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cell+seeding+density+and+nutrient+supply+for+articular+cartilage+tissue+engineering+with+deformational+loading.">The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading.</a> Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).</li><li>Mauck, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tissue+engineering+of+articular+cartilage+through+dynamic+loading+of+chondrocyte-seeded+agarose+gels.">Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels.</a> J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).</li><li>Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+bioreactor+for+physical+stimulation+of+engineered+cartilage.">Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage.</a> Biorheology. 40, 331-336 (2003).</li><li>Grad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+motion+upregulates+superficial+zone+protein+and+hyaluronan+production+in+chondrocyte-seeded+three-dimensional+scaffolds.">Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds.</a> Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).</li><li>Schatti, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+shear+and+dynamic+compression+leads+to+mechanically+induced+chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells.">A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells.</a> Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous avons conçu un dispositif de chargement qui est capable d&#39;appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à des constructions de l&#39;ingénierie tissulaire fabriqués pour la transplantation. L&#39;appareil peut être utilisé comme un bioréacteur pour la culture in vitro de biocomposites ingénierie ou comme un dispositif de contrôle de décrire les caractéristiques mécaniques du tissu natif ou après d&#39;autres traitements avant. Les sujets de périphériques conçus cons...

Nous avons conçu un bioréacteur de chargement qui est capable d&#39;appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à un tissu biocomposites ingénierie fabriqués à la transplantation. Ce dispositif est principalement conçu comme un bioréacteur pour les remplacements d&#39;ingénierie pour le cartilage articulaire, il pourrait également être utilisé pour d&#39;autres tissus porteurs dans le corps humain. Notre motivation dans cette conception de bioréacteur découle de Drachman et Sokoloff 1, qui a fait l&#39;observation séminale de formation anormale du cartilage articulaire dans des embryons de poulet paralysés en raison de l&#39;absence de mouvement. De même, l&#39;exercice physique est essentiel pour le développement du muscle normal et en os. En accord avec ce concept, de nombreux groupes de recherche ont étudié comment les différents modes de stimuli physiques pendant la culture in vitro module les propriétés biochimiques et mécaniques des biocomposites cellule de biomatériaux et d&#39;explants de tissus 2-7. Le concept de l&#39;ingénierie tissulaire fonctionnelleimplique l&#39;utilisation in vitro de stimuli mécaniques pour améliorer les propriétés fonctionnelles du tissu, à savoir les propriétés mécaniques qui permettent au tissu pour résister à la contrainte attendue in vivo et la souche 8,9. De nombreuses études font état d&#39;une charge mécanique de l&#39;utilisation en termes de cisaillement et de compression pour stimuler constructions de cartilage d&#39;ingénierie pour les joints articulaires. 10 Mauck et al. Suggèrent que le chargement mécanique seul peut induire chondrogénèse des cellules souches mésenchymateuses même en l&#39;absence de facteurs de croissance qui sont considérés comme essentiels. Application de la charge mécanique intermittente comme la compression ou de cisaillement lors de la culture de tissus a été montré pour moduler cartilage et la formation osseuse, mais la dosimétrie optimale de chargement diffère selon les propriétés des tissus et cellules 11. La fonction la plus importante du cartilage articulaire est la capacité à résister à des forces de compression et de cisaillement à l&#39;intérieurl&#39;articulation, donc il doit avoir une grande compression et modules de cisaillement. Le manque de résistance mécanique fonctionnelle et ultrastructure physiologique dans le cartilage d&#39;ingénierie a abouti à la répartition sur le néo-cartilage in vivo et l&#39;échec des stratégies de remplacement de cartilage dans les articulations. Bien que la compression et de cisaillement ont été fréquemment démontré à moduler et améliorer la résistance mécanique des biocomposites du cartilage articulaire, une approche combinée est rare 6,12-15. Wartella et Wayne 16 a conçu un bioréacteur qui applique la tension et de compression pour produire des substituts de cartilage du ménisque. Waldman et al. 15 conçu un dispositif pour appliquer une compression et un cisaillement de chondrocytes cultivés dans un substrat de polyphosphate de calcium poreux. Bian et al. 17 a démontré des propriétés mécaniques correspondant cartilage natif avec la culture in vitro des chondrocytes canins adultes dans les gels et l&#39;application de deux axes mechanical chargement (compression déformation chargement et coulissant charge de contact). Le bioréacteur de chargement mécanique biaxial a été initialement conçu par Danielle Chu dans notre laboratoire avec l&#39;objectif global d&#39;induire des adaptations morphologiques dans les tissus du cartilage fabriqué constructions obtenues dans des modules de compression et de cisaillement élevées que celles actuellement disponibles 18. Nous croyons que cette recherche permettra d&#39;accroître considérablement notre compréhension plus large de la façon dont mechanotransduction peut être modulée à l&#39;ingénieur cliniquement tissus concernés.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM, High glucose, pyruvate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose Type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAS 39346-81-1 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Glutamine 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ITS+ Premix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354352</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen Strep Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>041-95780</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-2218</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonessential Amino Acid Solution 100x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7145</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5607</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2915</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human Transforming Growth Factor &beta;1</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 31 Load Cell (1000 g)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AL311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Single Channel Display</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>SC500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LNR50SE/M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Two Channel Stepper Motor Controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BSC102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DRV014</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Adjustable Kinematic Locator (4)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KL02</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Precision Right Angle Plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP90/M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vertical Mounting Bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LNR50P2/M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Solid Aluminum Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB3030/M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates </td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1653312 and #1653310 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable Biopsy Punch, 5 mm</td>
			<td>Miltex, Inc.</td>
			<td>33-35</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16 mm hollow punch</td>
			<td>Neiko Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>351147</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>86735k19</td>
			<td>Custom-machined</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

design of a biaxial mechanical loading bioreactor for tissue engineering

Nous avons conçu un dispositif de chargement qui est capable d&#39;appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à un tissu biocomposites ingénierie fabriqués à la transplantation. Alors que le dispositif fonctionne principalement comme un bioréacteur qui imite les contraintes mécaniques indigènes, il est également équipé d&#39;une cellule de charge pour fournir une rétroaction de force ou les essais mécaniques des constructions. Les sujets de périphériques conçus constructions de cartilage à biaxial chargement mécanique avec une grande précision de la dose de charge (amplitude et fréquence) et est assez compact pour tenir dans un incubateur de culture tissulaire standard. Il charge échantillons directement dans une plaque de culture de tissus, et de multiples formats de plaques sont compatibles avec le système. Le dispositif a été conçu en utilisant des composants fabriqués pour les applications laser à guidage de précision. Chargement bi-axial est réalisé en deux phases orthogonales. Les étapes ont une gamme de voyage de 50 mm et sont entraînés indépendamment par stepper actionneurs automobiles, contrôlés parun pas à pas conducteur en boucle fermée du moteur qui offre des capacités de micro-pas à pas, ce qui permet des tailles de pas de moins de 50 nm. Une polysulfone chargement cylindre est couplé à la plate-forme mobile bi-axiale. Mouvements des étapes sont contrôlées par Thor-laboratoires de technologie de positionnement avancé (APT) de logiciels. Le moteur pas à pas est utilisé avec le logiciel pour régler les paramètres de charge de fréquence et d&#39;amplitude à la fois de cisaillement et de compression indépendante et simultanée. Les informations de localisation sont fournies par des codeurs optiques linéaires qui ont une répétabilité bidirectionnelle de 0,1 um et une résolution de 20 nm, traduisant une précision de positionnement inférieure à 3 um sur la totalité de 50 mm de course. Ces codeurs fournissent la rétroaction de position nécessaire à l&#39;électronique de commande pour assurer véritables capacités nanopositionnement. Afin d&#39;assurer le retour de force pour détecter le contact et d&#39;évaluer les réponses de chargement, une cellule de charge miniature de précision est positionné entre le plateau de chargement et le Movinplate-forme g. La cellule de charge a une précision élevée de 0,15% à 0,25% de la pleine échelle.

Le dispositif a été testée en utilisant des gels d&#39;agarose ensemencé avec 20 millions de cellules / ml et les chondrocytes cultivés en présence d&#39;uniaxiale (compression) ou bi-axiale (compression et de cisaillement) chargement mécanique. Chondrocytes porcins primaires ont été isolés du cartilage articulaire des porcs âgés de 2-4 mois. 5 mm de diamètre et des échantillons de 1,5 mm d&#39;épaisseur ont été cultivées dans 2 ml de milieu de culture chondrogénique défini (DMEM riche en glucose, 1%...

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Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Nous avons conçu un nouveau bioréacteur de chargement mécanique qui peut appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à une biocomposites du cartilage avant la transplantation dans un défaut de cartilage articulaire.

Conception d&#39;un bioréacteur de chargement mécanique biaxial pour l&#39;ingénierie tissulaire

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

design-biaxial-mechanical-loading-bioreactor-for-tissue

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Bioengineering

Unit 1

Analysis and Design of Beams for Bending

SCIENTISTS IN ACTION

14.2K vues.  The Warren Alpert Brown Medical School of Brown University and the Rhode Island Hospital. Nous avons conçu un nouveau bioréacteur de chargement mécanique qui peut appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à une biocomposites du cartilage avant la transplantation dans un défaut de cartilage articulaire.

Vidéo: Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Greffes d&#39;ingénierie biologique vasculaire basé sur l&#39;aide d&#39;un bioréacteur pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Recherche

Bio-ingénierie

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Traitement post-production des fibres électrofilées de génie tissulaire

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

Fonctionnement d&#39;un bioréacteur de laboratoire

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Conception et construction de la matrice extracellulaire artificielle (AECM) Protéines de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Pour l&#39;ingénierie tissulaire de la peau

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Génie tissulaire par Intrinsic vascularisation dans un<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Chambre Ingénierie

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.

Collagène recombinant j’ai microporteurs de Peptide pour l’Expansion des cellules et leur utilisation potentielle comme système de diffusion de cellule dans un bioréacteur modèle

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a conventional optical system with an integrating sphere. Measuring systems for the acquisition of the diffuse reflectance and total transmittance spectra are constructed with a broadband white light source, a light guide, an achromatic lens, an integrating sphere, a sample holder, an optical fiber probe, and a multi-channel spectrometer. An acrylic mold consisting of two rectangular acrylic pieces and a U-shaped acrylic piece is constructed to create an epidermal phantom and a dermal phantom with whole blood. The application of a sodium dithionite (Na2S2O4) solution to the dermal phantom enables the researcher to deoxygenate hemoglobin in red blood cells distributed in the dermal phantom. The inverse Monte Carlo simulation with the diffuse reflectance and total transmittance spectra measured by a spectrometer with an integrating sphere is performed to determine the absorption coefficient spectrum &#181;a(&#955;) and the reduced scattering coefficient spectrum &#181;s&#39;(&#955;) of each layer phantom. A two-layered phantom mimicking the diffuse reflectance of human skin tissue is also demonstrated by piling up the epidermal phantom on the dermal phantom.

Here, we demonstrate how agarose-based tissue-mimicking optical phantoms are made and how their optical properties are determined using a conventional optical system with an integrating sphere.

Axée sur l’agarose tissus imitant les fantômes optiques pour la spectroscopie de réflectance Diffuse

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

Biaxiales caractérisations mécaniques des valvules auriculo-ventriculaire

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also respond to neural injuries and act to protect the tissue from degenerative events. In vitro studies of astrocytes&#39; functionality are important to elucidate the mechanisms involved in such events and contribute to developing therapies to treat neurological disorders. This protocol describes a method to biofabricate a neural-like tissue structure rich in astrocytes by 3D bioprinting astrocytes-laden bioink. An extrusion-based 3D bioprinter was used in this work, and astrocytes were extracted from C57Bl/6 mice pups&#39; brain cortices. The bioink was prepared by mixing cortical astrocytes from up to passage 3 to a biomaterial solution composed of gelatin, gelatin-methacryloyl (GelMA), and fibrinogen, supplemented with laminin, which presented optimal bioprinting conditions. The 3D bioprinting conditions minimized cell stress, contributing to the high viability of the astrocytes during the process, in which 74.08% &#177; 1.33% of cells were viable right after bioprinting. After 1 week of incubation, the viability of astrocytes significantly increased to 83.54% &#177; 3.00%, indicating that the 3D construct represents a suitable microenvironment for cell growth. The biomaterial composition allowed cell attachment and stimulated astrocytic behavior, with cells expressing the specific astrocytes marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and possessing typical astrocytic morphology. This&#160;reproducible protocol provides a valuable method to biofabricate 3D neural-like tissue rich in astrocytes that resembles cells&#39; native microenvironment, useful to researchers that aim to understand astrocytes&#39; functionality and their relation to the mechanisms involved in neurological diseases.

Here we report a method of 3D bioprinting murine cortical astrocytes for biofabricating neural-like tissues to study the functionality of astrocytes in the central nervous system and the mechanisms involving glial cells in neurological diseases and treatments.

Bioimpression 3D d’astrocytes corticaux murins pour l’ingénierie de tissus de type neural

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...