Ce travail a été soutenu en partie par des subventions des NIH, R44 et R01 GM087784 HL109505. Auteurs remercient l&#39;équipe technique et OEM à Gilson, INC pour le support technique étendu.

Les auteurs MKC, MJG, BEE, NJD et RO sont ou étaient à l&#39;époque des employés de développement de InvivoSciences, INC qui a conçu et développé des protocoles robotiques décrites ici. TW est le SSP pour InvivoSciences INC. SH est un employé de Gilson INC.

Dans la présente étude, nous avons développé une méthode de culture robotique pour la production iPSC que miniaturise et automatise l&#39;alimentation et le passage dans un format de plaque à 96 puits, tout en permettant une échelle efficace jusqu&#39;à. Un robot de manipulation liquide a été utilisé pour nourrir régulièrement colonies iPSC et leur passage à intervalles réguliers par dissociation enzymatique. Le robot est également programmé pour produire des plaques revêtues de gel de la matrice extracellulaire et effectuer un gradient de densité d&#39;ensemencement. Lorsque fibroblastes et adipeux dérivé iPSCs ont été cultivées dans ce système pendant plus de 20 passages, environ 3 mois, la pluripotence a été maintenue, tout comme les caryotypes stables. Les deux lignées cellulaires sont capables de différenciation en cardiomyocytes. Ensemble, la collecte des protocoles décrits ici permet aux utilisateurs avec très peu d&#39;expérience de la culture de cellules souches, ou l&#39;accès limité à l&#39;équipement de culture spécialisée, à la culture de cellules souches et d&#39;atteindre la production de cellules de haute ou de la manipulation avec un minimum de travail et le coût multi-ligne. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Les protocoles robotiques détaillées ici fournissent une méthode pour l&#39;échelle économique de la production et de la manutention iPSC. Un avantage est la culture de cellules souches évolutive dans un format basé sur plaque établie démontré ici et précédemment 44,47 - 49 pour maintenir la pluripotence. Alors que d&#39;autres formats de cellules pluripotentes de rendement de la culture de cellules souches évolutive 20,23,29 méthode basée sur cette plaque nécessite pratiquement pas de changement de format de la culture, comme l&#39;adaptation à la suspension, l&#39;utilisation de produits chimiques anti-mousse ou l&#39;utilisation prolongée de la Rho-kinase inhibiteur 20. Cette méthode de la plaque base peut donc rapidement, et de façon prévisible, accueillir de nouvelles lignes parce que les conditions de culture sont similaires. Comme l&#39;utilisation des CSPi pour la modélisation de la maladie augmente 4,6,19,50, de nouvelles lignes iPSC sont générées en continu. Les techniques décrites ici sont les mieux adaptés à la culture nouvelle lignes dans un milieu à haut volume et le débit parce que la barrière à la transition sur le format est low. Cela est également vrai pour le travail et l&#39;équipement nécessaire pour maintenir les colonies. Enfin, parce que le format et la manipulation sont similaires à l&#39;environnement utilisé pour calculer et valider les lignes iPSC, le rendement de la culture, tels que la différenciation dirigée, est susceptible d&#39;être plus prévisible. La figure 8 illustre une stratégie de mise à l&#39;échelle de la production de cellules souches dans des plaques à 96 puits. Une plaque (Cycle 0) est utilisée pour ensemencer robotisée 12 nouvelles plaques, une augmentation de 12 fois (cycle 0 à 1). Après plusieurs jours d&#39;alimentation, l&#39;un des douze plaques est à des passages pour ensemencer une autre série de douze plaques (cycle 1 au cycle 2). Les plaques onze autres sont maintenant disponibles pour d&#39;autres usages et représentent la composante de la production du système. À ce rythme, le passage d&#39;une plaque fournira 11 plaques chaque cycle, ou tous les 3-4 jours. Cette méthodologie peut être mise à l&#39;échelle plus lorsque plusieurs plaques sont soumises à des passages comme représenté sur la transition de cycle 2 au cycle 3. Au cycle 3, deux plaques sonttoujours utilisé pour maintenir la colonie et des graines 24 de nouvelles plaques. Les 22 plaques restantes sont alors disponibles pour une utilisation après chaque cycle de passage. À tout moment dans le cycle de maintenance, l&#39;utilisateur peut semer plusieurs plaques pour augmenter la production. Un exemple consisterait à chaque passage sur la colonne pour deux cycles de croissance. Le premier passage convertit une plaque en douze plaques, et chacun des douze plaques est utilisée pour ensemencer 144 plaques. Dans ce cas, un utilisateur commence par une plaque et après deux passages, ou environ 1,5-2 semaines de culture, compte 144 plaques. Par exemple, les fibroblastes et adipeux lignes iPSC rendement d&#39;environ 25 à 75.000.000 cellules par plaque de 96 puits lorsqu&#39;il est prêt au passage. 144 plaques pourraient donc représenter environ 4-7 x 10 9 cellules. Quelle est la charge de travail pour la réalisation de 144 plaques à 96 puits robotisée? L&#39;un des objectifs de ce travail était évolutive production de cellules souches qui a réduit la main-d&#39;œuvre par rapport à (plaque-à-dire, 6 puits) traditionnelle culture de cellules souches. L&#39;acc robotomplishes ce en allégeant la nécessité de manipuler physiquement chaque plaque lors de l&#39;alimentation et de passages. Bien que les échelles de production de plaques à 96 puits comme il serait linéairement dans des plaques à 6 puits traditionnels, le temps de travail d&#39;un technicien passe avec les plaques est sensiblement inférieure à l&#39;aide de la culture robotique. L&#39;efficacité de la culture de production robotisé est dérivée de cette différence (Figure 9). Il a été constaté techniciens pourraient retirer une plaque de 6 puits de l&#39;incubateur, vérifier sur le microscope, puis aspirer et nourrir la plaque dans environ 3,5 minutes. En comparaison, les techniciens passent environ 30 sec enlever une plaque de 96 puits de l&#39;incubateur et l&#39;inspection sur le microscope de la densité et de la contamination avant de le placer sur le robot. Avec un protocole élargi d&#39;alimentation similaire à celle décrite ci-dessus, six plaques à 96 puits peuvent être chargés et alimentés, ce qui prend environ 21 minutes, ou 3,5 minutes par plaque. Le temps total écoulé pour nourrir une plaque est comparable entre les robotsic et des méthodes manuelles, mais à alimentation manuelle 6 assiettes un technicien est nécessaire pour toutes les 21 min alors que le technicien ne consacre que 3 manipulation des six plaques pour le robot (une inspection de 30 secondes par assiette) min. Comme la figure 9 montre, le temps d&#39;un technicien passe manipulation 144 plaques à l&#39;aide du robot est d&#39;environ 1,2 heures par opposition à 8 h à la main et le robot ne pourra jamais faire une erreur de manipulation des plaques ou le transfert de liquides. Les 96 puits iPSC méthodes de culture décrites ici fournissent une plate-forme traitable pour les tâches de contrôle complexes. Parce que chaque puits est génétiquement identique et ensemencé à la même densité dans le même bassin initial, les variables peuvent être distribués à travers la plaque et entretenus par le robot avec des réservoirs disponibles dans le commerce pour séparer les conditions. Cela serait utile pour des expériences telles que la croissance sur les cellules souches de support 34,35,47 développement, le test de substrat ou de l&#39;état de la culture et des études de toxicité en utilisant des cellules souches51. Étant donné que chaque ligne de cellules souches est unique en termes d&#39;exigences optimales de taille de la colonie et de passage, on peut utiliser ce système pour moduler la densité ensemencement, la fréquence d&#39;alimentation et la manipulation de passage en manipulant les colonnes récoltés, l&#39;agitation mécanique pendant le passage et la fréquence d&#39;alimentation. En parcourant ces variables permettra à l&#39;utilisateur de trouver rapidement un ensemble de conditions appropriées pour la culture d&#39;une nouvelle ligne ou de développer de nouvelles techniques de culture. Le robot est aussi capable de maintenir 96 colonies de cellules souches parallèles mais indépendants. Lorsque iPSC sont dérivées de cellules somatiques ou clone après manipulation génétique, de nombreux clones sont criblés en parallèle pour donner des lignes iPSC potentiels. Une fois que des cellules individuelles sont ensemencées dans des plaques à 96 puits, ce système peut se nourrir et de passage des plaques à 96 puits en gardant chaque colonie distincts. Cela permet un débit très élevé lors de la sélection des clones potentiels et élimine la difficulté de la culture physique 96 lignes parallèles. Cette méthode aussi unP ermet à plus grande échelle la production de chaque clone sorte que le matériau est facilement disponible pour une analyse parallèle. Enfin, nous envisageons l&#39;intégration de ces techniques de culture avec un système de traite robotisé de la plaque qui délivre plaques et de l&#39;incubateur permettant la culture entièrement automatisé. Cela pourrait être accompli avec la robotique plus complexes qui permettent une plus grande expansion depuis les protocoles de base décrites ici sont transférables à d&#39;autres systèmes basés sur des plaques. Les premières étapes essentielles à aborder dans les protocoles sont ceux qui préviennent et vérifier la contamination telle que les étapes 1,5 et 4,2. Contamination, comme discuté ci-dessus, peut être évitée avec succès si bonne technique stérile et le bon sens sont utilisés. Il est impératif, indépendamment du format de la culture de cellules souches, que le contrôle de l&#39;opérateur de la contamination et de le faire dans ce protocole dans les étapes indiquées permettra de réduire considérablement le risque de contamination. L&#39;application du gel de la matrice extracellulaire adéquate est une seconde essétape tielle à la réussite globale de ce protocole. Sans bien enrober les plaques à 96 puits, les cellules souches ne se développent pas. Un problème commun est le revêtement de puits incomplètes. L&#39;expérience a montré que les bulles d&#39;air, l&#39;attraction électrostatique et capillarité entravent revêtement de complet bien. L&#39;étape de pré-mouillage (1.6) a été développé pour améliorer de manière significative revêtement de fond de puits et ne doit pas être ignorée. Cette étape de pré-mouillage semble réduire l&#39;hydrophobie apparente de la plaque de 96 puits en plastique de telle sorte que lorsque le revêtement de gel de la matrice extracellulaire est appliqué, il est réparti uniformément à travers le fond du puits et sur les côtés. Il est également recommandé de taper doucement les plaques à 96 puits contre une main propre une fois revêtu pour assurer la distribution de solution de gel de la matrice extracellulaire même. Les paramètres de dissociation sont également importantes pour optimiser. Incubation prolongée avec une enzyme ou un réactif de dissociation de l&#39;EDTA sur la base se traduira par des cellules individuelles qui peuvent ou peuvent ne pas être l&#39;objectif au cours du passage. Par conséquent, l&#39;opérateurdevraient accorder une attention particulière à la façon dont le temps de dissociation, la force de trituration, et les répétitions de lavage affectent la morphologie des colonies et de la santé et d&#39;ajuster en conséquence. Comprendre les limites des techniques décrites ici sont primordiale pour le bon fonctionnement. Comme dans n&#39;importe quel autre paramètre de culture cellulaire, l&#39;utilisation de plaques à 96 puits présente un risque de contamination relativement élevé. Comme décrit ci-dessus, un technicien est le traitement de chaque plaque lors de l&#39;alimentation et des passages; par exemple, lors de l&#39;ouverture du couvercle, en mettant la plaque sur le lit de robot, et la vérification de la plaque sur le microscope. Par conséquent, comme l&#39;a noté après l&#39;étape 1.5, il est impératif de ne pas toucher l&#39;intérieur d&#39;un couvercle de plaque ou exposer cette partie à toute surface potentiellement contaminés tels que les blocs de chauffage en pente ou des broches verticales sur le lit. Au cours de l&#39;élaboration du protocole de cette limitation a été découvert et a donné l&#39;impulsion pour développer un rack de tenir les couvercles de la plaque pour maintenir la stérilité. De même, les réservoirs de dépression, embouts de pipette et outres fournitures sur le liquide lit robot de manutention sont des sources potentielles de contamination, car ils sont ouverts à l&#39;environnement et géré par le technicien. Par conséquent, une bonne technique stérile doit être appliquée comme la réduction des mouvements sur les matières de culture exposées ou liquides ouverts. Une autre limitation est que lorsque le protocole est entartré, vérifier visuellement tous les puits de&gt; 100 plaques à 96 puits est lourd. Cela peut être traitée par une inspection visuelle de l&#39;ensemble de la plaque des signes de contamination, tels que les médias trouble, pour identifier les puits suspectes. Pour l&#39;avenir jusqu&#39;à l&#39;échelle, l&#39;utilisation d&#39;un microscope automatisé et l&#39;indicateur de la croissance cellulaire et la contamination potentielle sera incorporé. En résumé, le 96 puits plate-forme haut débit décrit ici propose une méthode reproductible, haute fidélité pour la culture et la production de cellules souches dans un format de plaque. Cette méthode réduit l&#39;expérience requise, l&#39;équipement et la main-d&#39;œuvre temps nécessaire dédiée à la culture de cellules souches touten conservant les avantages de la culture traditionnelle adhérente.

L&#39;utilisation de cellules souches pluripotentes humaines induites (CISP) a considérablement augmenté depuis leur dérivation en 2007 1 pour les essais en enclos, la médecine régénérative et de la modélisation de la maladie 2-6. Cette demande vient de la capacité de iPSC pour obtenir un grand nombre de cellules pluripotentes qui peuvent être différenciées en cellules somatiques à une quantité inégalée. Comme les techniques de différenciation dirigés améliorer 7-10 et le développement de cellules humaines ou la modélisation de thérapie tissulaire et cellulaire augmente: 11 - 14, le fait de l&#39;exigence de production de masse de CSPi de haute qualité. Il est largement cité qui, entre autres maladies, infarctus du myocarde ou remplacement fonctionnel des cellules B, il faudra des centaines de millions à des milliards de iPSC dérivée de cellules somatiques 15-18. La modélisation 3D des tissus En outre, de plus en plus complexe pour la découverte de médicaments et de therapy exigeront un grand nombre de cellules 9,13,19. Dans tous ces exemples, définis, uniforme et CSPi reproductibles doivent être disponibles et simples à produire. Afin de produire des souches biopharmaceutique et des cellules dérivées de cellules pour l&#39;ingénierie tissulaire et la transplantation, une technologie cellulaire de fabrication rentable est essentiel. La production à l&#39;échelle des CSPi a mis l&#39;accent sur ​​la culture de la suspension de 20 à 25 ou de la suspension de l&#39;utilisation de substrats microporteuses 26 - 28 en partie parce que ces techniques sont déployés avec succès à grande échelle, non-iPSC, la production à base de eucaryote. Plusieurs groupes ont mis en évidence des systèmes de culture en suspension qui produisent des cellules souches pluripotentes 20,21,23,24,29. Cependant, ces approches utilisent des systèmes complexes et coûteux ne sont pas facilement disponibles pour les chercheurs en développement de nouveaux programmes de différenciation, de conduire l&#39;ingénierie tissulaire et de faire laboratla recherche à l&#39;échelle ory. En outre, la suspension et microporteuses cultures iPSC nécessitent une adaptation et des techniques ou des produits chimiques ne figurent pas dans la culture traditionnelle adhérente iPSC telles que l&#39;utilisation continue de l&#39;inhibiteur de la Rho-kinase, les agents anti-mousse et de filtration pour réguler l&#39;agrégation. Le stress physique aux cellules est plus répandu en culture en suspension, introduit par agitation mécanique ainsi que lors de la collision microporteur. Ces problèmes limitent la prévisibilité et la vitesse à laquelle nouvellement généré lignées de cellules souches peuvent être cultivées en suspension. D&#39;autres ont développé des systèmes de manutention de plaques robotiques qui imitent plaque techniques de culture 30,31 mais ces plates-formes exiger d&#39;importants investissements pour l&#39;équipement et l&#39;expertise pour exploiter en plus des défis fondamentaux associés à la culture de cellules souches. Le travail suivant décrit le développement et la pratique d&#39;un système évolutif de la culture iPSC qui utilise un liquide robotique 8-canal standard autonomegestionnaire et des plaques à 96 puits. Cette méthode a été conçu pour combler l&#39;échelle du laboratoire iPSC culture et à haut volume de production iPSC (par exemple, 10 de 7 à 1,5 x 10 9 cellules par semaine et par technicien) permettant ceux qui développent de nouvelles technologies iPSC faire évoluer facilement jusqu&#39;à la production sans investissements importants de matériel ou de main-d&#39;œuvre. Cette méthode est relativement peu coûteux à mettre en place, nécessite peu ou pas d&#39;expérience de la culture de cellules souches, de la programmation ou de l&#39;ingénierie, a une petite empreinte équipement sans la nécessité d&#39;une hotte de culture cellulaire dédié, et utilise l&#39;équipement de culture cellulaire standard pour permettre à moyen et à haut débit automatisé la production de cellules. L&#39;objectif était de développer un système capable de la culture de cellules souches évolutive qui peut être utilisé par les laboratoires de nouvelles pour enrayer la culture de cellules, ceux qui trouvent culture manuelle un obstacle au développement de leurs idées ou de ceux qui veulent un moyen économique de produire de grandes quantités de cellules souches. La plate-forme présentée ici supprime influence technicienla culture de cellules souches et normalise les procédures d&#39;alimentation et de passage pour permettre la production de cellules souches cohérente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>96-well; Well volume: 360uL; Cell growth area: 0.32cm2; Individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Trough</td>
			<td>SeahorseBio</td>
			<td>201308-100</td>
			<td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167023</td>
			<td>10 racks gilson 96tips D200 tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F12 powder.&#160; Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred to as, &#34;extracellular matrix gel&#34; in the text.&#160; Matrigel GFR, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5857</td>
			<td>mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 Media</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>AdooQ BioScience</td>
			<td>A11001-50</td>
			<td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>ACCUTASE</td>
			<td>Referred to as, &#34;proteolytic and collagenolytic dissociation reagent&#34; in the text.&#160; Accutase 500 mL sterile cell solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td>PBS w/o CA MG 500 mL, 6/pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson PIPETMAX</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PIPETMAX</td>
			<td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system

Progression continue dans la culture de cellules souches pluripotentes est de combler l&#39;écart entre banc et chevet pour l&#39;utilisation de ces cellules en médecine régénérative, la découverte de médicaments et de tests de sécurité. Afin de produire des souches biopharmaceutique et des cellules dérivées de cellules pour l&#39;ingénierie tissulaire et la transplantation, une technologie cellulaire de fabrication rentable est essentiel. Le maintien de la pluripotence et une performance stable de cellules dans les applications en aval (par exemple, la différenciation cellulaire) dans le temps est primordial pour une production à grande échelle de la cellule. Pourtant, qui peut être difficile à atteindre, surtout si les cellules sont cultivées manuellement où l&#39;opérateur peut introduire une variabilité importante ainsi que être prohibitif à l&#39;échelle supérieure. Pour permettre à haut débit, la production de cellules souches à grande échelle et supprimer des protocoles de culture de cellules souches roman d&#39;influence de l&#39;opérateur à l&#39;aide d&#39;une paillasse multi-canal robot de manipulation de liquide ont été développés qui nécessitent une participation minimale de technicien ou d&#39;expérience. Avecces induites cellules souches pluripotentes humaines protocoles (CISP) ont été cultivées dans des conditions sans alimentation directement à partir d&#39;un stock congelé et maintenus dans des plaques à 96 puits. En fonction de la lignée cellulaire et le taux de mise à l&#39;échelle désirée, l&#39;opérateur peut facilement déterminer le moment de passage basée sur une série d&#39;images montrant les densités de colonies optimales pour le fractionnement. Ensuite, les réactifs nécessaires sont prêts à effectuer une répartition de la colonie de nouvelles plaques sans étape de centrifugation. Après 20 passages (~ 3 mois), deux lignes iPSC maintenus caryotypes stables, ont exprimé des marqueurs de cellules souches, et différenciées en cardiomyocytes avec une grande efficacité. Le système peut effectuer ultérieur criblage à haut débit de nouveaux protocoles de différenciation ou manipulation génétique conçus pour plaques à 96 puits. Cette technologie permettra de réduire la charge de travail et technique pour produire un grand nombre de cellules souches identiques pour une myriade d&#39;applications.

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Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

Scalable plaque de 96 puits Basé iPSC Culture et production en utilisant un système robotique Liquid Handling

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

scalable-96-well-plate-based-ipsc-culture-production-using-robotic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

31.4K vues.  InvivoSciences, Inc.. The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes. 

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Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Encapsulation alginate de cellules souches pluripotentes en utilisant une buse de co-axiale

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Recherche

Biologie du développement

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

Méthode d&#39;étude Palatal Fusion utilisant statique Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Clonage fonctionnelle en utilisant un<em&gt; Xenopus</em&gt; Système d&#39;expression de l&#39;ovocyte

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Suivi des cellules dans le poisson zèbre transgénique de la GFP-Utilisation du système photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

La production de cellules souches pluripotentes de souris amniotique Cellules Fluid Utilisation d&#39;un système de transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Un dispositif pour effectuer la migration cellulaire / Wound Healing dans une plaque à 96 puits

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Xeno-libre défini et exempte d’engraissement des Conditions de Culture pour les modèles de cellule rétinienne Generation of Human dérivés iPSC

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

Un modèle In Vitro d’un système de Perfusion de plaques parallèles pour étudier l’adhérence bactérienne pour greffer des tissus

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Système d'analyse d'angiogenèse tridimensionnel utilisant des sphéroïdes de co-culture formés par des cellules de formation de colonies endothéliales et des cellules souches mésenchymales

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...