We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).

REMARQUE: Suivez tous les règlements institutionnels concernant l&#39;utilisation et l&#39;élimination des matières radioactives, y compris mais sans s&#39;y limiter, l&#39;utilisation des équipements de protection individuelle, comme des gants, des lunettes de sécurité, blouse de laboratoire, et des boucliers acryliques appropriés. NOTE: Le tampon standard est constitué de 40 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM de glutamate de potassium, 5 mM de DTT, 0,1 mM d&#39;EDTA (ce tampon est préalablement effectué à une concentration de 5x) et 0,3 mM de chaque dNTP. Protéines de replication de T7 sont purifiés comme décrit 8, 9, 10. ADN simple brin contenant une T7 unique de reconnaissance primase place (5 &#39;GGGTC-3&#39;, 5&#39;-GTGTC-3 &#39;, 5&#39;-TGGTC-3&#39;) peut être acheté parmi une variété de sociétés de synthèse d&#39;ADN (la longueur de l&#39;ADNsb peut dépendre de l&#39;enzyme de choix pour la T7 primase, un pentamère est la longueur de gabarit minimal pour synthétiser une amorce de pleine longueur 11, comme le cryptique C est essentiel, cependant, si l&#39;amorce doit être prolongée par polymérase, des nucléotides supplémentaires doivent être présents à l&#39; extrémité 3 &#39;de la matrice. Les réactions sont initiées par l&#39;addition d&#39;une concentration finale de 10 mM MgCl 2 et incubées à 25 ° C. échantillonnage manuel fonctionne bien pour les points de temps de 5 secondes ou plus. Si points de temps plus courts que sont nécessaires, il est recommandé d&#39;utiliser un instrument d&#39;écoulement rapide trempe pour obtenir des données précises. 1. Multiple-CA Primer Synthèse Reaction par échantillonnage manuel <ol><li> Avant de commencer l&#39;expérience, aliquoter 2 ul de tampon de colorant formamide (93% (v / v) de formamide, 50 mM d&#39;EDTA, 0,01% de xylene cyanol et 0,01% de bleu de bromophénol) dans 8 tubes de 1,5 ml en polypropylene. En général, le nombre de tubes est égal au nombre de points temporels analysés. </li><li> Préparer un mélange de 20 ul constitué tampon 1x, 0,1 mM d&#39; ATP et CTP, 0,25 mCi / mL [α- 32 P] CTP, 0,1 uM ssdNA modèle, et 0,1 uM GP4 (exprimée en concentration de hexamère - monomère 0,6 uM). </li><li> Incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Retirer 2 pl du mélange à l&#39;aide d&#39;une pipette et mélanger avec 2 pi de tampon de colorant formamide dans un tube de 1,5 ml préparé à l&#39;étape 1.1 pour le pas de contrôle de réaction (temps zéro). </li><li> Ajouter 2 ul de 0,1 M de MgCl 2 au mélange réactionnel (à une concentration finale de 10 mM). </li><li> retirer manuellement 2 pi des échantillons des mélanges réactionnels à l&#39;aide d&#39;une pipette à intervalles de 10 secondes et mélanger avec un colorant formamide predispensed dans des tubes de 1,5 mL préparés à l&#39;étape 1.1. </li><li> Des échantillons de chaleur à 95 ° C pendant 5 minutes dans un bloc chauffant. </li><li> Charger des aliquotes des échantillons sur un gel dénaturant. Les petits produits d&#39;amorce de tetraribonucleotide synthétisés par la primase T7 sont bien réglées sur une épaisseur de 0,4 mm 25% d&#39;acrylamide: bisacrylamide (19: 1), 3 M d&#39;urée, 1 x TBE (Tris-borate 100, 1 mM d&#39;EDTA). </li><li> Placez tout le gel sur la chromapapier phie et la couverture d&#39;une pellicule plastique. gel sec en utilisant un séchoir à gel. </li><li> Préparer une série de dilutions du reste du mélange réactionnel et détecter le même volume chargé sur le gel sur du papier de Chromatographie, à savoir repèrer 4 ul de la dilution si 4 pi d&#39;échantillon ont été chargés. NOTE: Cela servira de la courbe standard pour déterminer la concentration des produits formés lors de la réaction. Par exemple, des dilutions de cinq fois à l&#39; aide du tampon TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM) fonctionnent bien, couvrant une gamme de 1:25 à 1: 15.625 (5 2 -5 6), mais les dilutions devraient être ajustée en fonction du niveau d&#39;activité. </li><li> Exposer gel sec et standard en utilisant un écran de phosphorimager. Quantifier la radioactivité dans la série de dilution et de construire une courbe standard tel que décrit 8, 12 NOTE: L&#39; inclusion de l&#39; ADN polymerase T7 au mélange de réaction permet de Examine de l&#39;utilisation d&#39;amorces tetraribonucleotide par cette enzyme. De manière optimale, la concentration de la polymerase doit être saturante pour simplifier l&#39;interprétation des données. Une concentration de la polymérase de 0,4 uM ou plus donne de bons résultats. En outre, l&#39;effet d&#39;autres protéines, telles que des protéines de liaison simple brin d&#39;ADN, de part et d&#39;amorce de synthèse ou en retard brin d&#39;initiation peut être examiné de cette façon. </li></ol> 2. Multiple-chiffre d&#39;affaires Primer Synthèse Reaction l&#39;aide d&#39;un instrument rapide trempe <ol><li> Préparation des mélanges réactionnels <ol><li> Préparer 400 pi de solution A, contenant un tampon 1x, 0,2 uM GP4 hexamère, 0,2 uM ADNss modèle, mM dNTP 0,6, 0,2 mM ATP et CTP (y compris 0,5 mCi / mL [α- 32 P] CTP. </li><li> Préparer 400 pi de solution B, contenant 1 x tampon et 20 mM de MgCl 2. </li></ol></li><li> Le fonctionnement de l&#39; instrument d&#39;écoulement rapide trempe <ol><li> Allumez le rapinstrument d&#39;écoulement id-trempe; après que le menu principal apparaît, le type 7 sur le clavier de l&#39;instrument pour déplacer le conducteur de la seringue à sa position d&#39;origine. </li><li> tampon Position ouverte de la seringue pour &quot;LOAD&quot;. </li></ol></li><li> Seringues tampon de chargement <ol><li> Fixer une seringue de 10 ml contenant du tampon à l&#39;orifice de la seringue de commande. Changer la position du bouton de la seringue pour &quot;LOAD&quot;. </li><li> En utilisant des seringues de 10 ml, remplir le réservoir tampon de l&#39;appareil A et B avec 10 mM de Tris, pH 7,5, EDTA 1 mM et remplir la seringue C avec une solution de trempe (250 mM d&#39;EDTA et 0,2% de SDS). Retirer les bulles d&#39;air en poussant des plongeurs et sortir. </li><li> Changez la position de bouton pour &quot;FIRE&quot;. Tapez 2 pour ajuster la position de la barre de pilote de seringue. Appuyez sur le bouton &quot;DIMINUER&quot; pour abaisser la seringue jusqu&#39;à ce tampon sort la boucle de sortie: (7 descend en continu; 8-grand pas vers le bas; 9-petit pas vers le bas). Tapez &quot;ESC&quot; pour revenir au menu principal. </li></ol></li><li> Laver les tubes <ol><li> attach ligne de sortie à vide. Changer les boutons échantillons à &quot;FLUSH&quot;. Fermer le tampon seringue en réglant les potentiomètres à la position horizontale. Allumez le vide et tremper les boucles 2 affleurants en H 2 O pendant 10 s, puis tremper dans MeOH pendant 10 s. boucles sèches par aspiration d&#39;air pour ~ 15 s, ou jusqu&#39;à ce que sec. </li></ol></li><li> Échantillons de chargement <ol><li> Changer l&#39;échantillon position du bouton à &quot;LOAD&quot;. Placer la solution A dans 1 ml seringue. Brancher une seringue dans l&#39;un des orifices de charge de l&#39;échantillon. Répétez l&#39;opération pour la solution B, et placer dans un face port de chargement de l&#39;échantillon. </li></ol></li><li> La collecte de points de temps <ol><li> Sur le menu principal, tapez 1 pour la course trempe-débit. Entrez le temps (s) de réaction et appuyez sur &quot;ENTRER&quot;. Le numéro de boucle de réaction à utiliser sera affiché. Passer en boucle de réaction nécessaire. procédure de lavage Répétez l&#39;étape 2.2.4. </li><li> Tournez les boutons échantillons à &quot;LOAD&quot;. réaction de charge se mélange dans des boucles d&#39;échantillons jusqu&#39;à ce que juste à l&#39;extérieur du compartiment de mélange central. Tournez tous les boutons à &quot;FIRE &quot;. Assurez-vous que tous les boutons sont dans la bonne position. </li><li> Placer le tube de 1,5 ml sur l&#39;extrémité de la boucle de sortie. Appuyez sur &quot;GO&quot; pour lancer la réaction. procédure de lavage Répétez l&#39;étape 2.2.4. Recharger seringues tampons A et B jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent le pilote. </li><li> Répétez les étapes 2.2.6.2-2.2.6.3 pour chaque point de temps désiré. Exception: Ne chargez pas la solution contenant le réactif de départ (ie, MgCl 2 dans ce cas) lorsque la trempe de la commande à zéro point de temps. </li><li> Lorsque vous avez terminé la collecte des échantillons, entrez &quot;ESC&quot; pour revenir au menu principal. Appuyez sur &quot;7&quot; pour revenir de seringue tampon à sa position d&#39;origine. </li></ol></li><li> Instrument de nettoyage <ol><li> Retirer les seringues du mélange réactionnel. Tournez le chargement des échantillons bouton à la position &quot;LOAD&quot;. Sous vide, lavez chaque boucle d&#39;échantillon avec 0,2 mL NaOH 10 N, puis 10 ml 0,3 NH 3 PO 4 et 10 ml de MeOH. </li><li> Tournez les boutons de la seringue pour la position &quot;LOAD&quot;. Appuyez sur tous les 3 syrpoinçons inge pour récupérer réaction et trempe des tampons. Laver seringues au moins deux fois avec 5 ml H 2 O. </li><li> Remplir les seringues à nouveau avec 5 ml H 2 O et tourner les boutons en position &quot;FIRE&quot;. Changer les positions de bouton et tourner le vide pour éliminer H 2 O. Flush comme à l&#39; étape 2.2.4. Eteignez instrument. REMARQUE: Les produits sont analysés comme décrit dans les étapes 1.7-1.12. En outre, l&#39;ADN polymerase T7 et d&#39;autres protéines de replication peuvent être ajoutés dans le mélange réactionnel pour analyser leur effet sur la synthèse ou l&#39;extension d&#39;amorce. </li></ol></li></ol> 3. Single-CA Primer Synthèse Reaction NOTE: simple rotation des essais primaire synthèse / extension sont effectuées de manière similaire à des réactions multiples chiffre d&#39; affaires, avec quelques différences majeures: ces essais suivent la conversion de radiomarqué ATP dans l&#39; amorce ou d&#39; extension des produits, mais la concentration de substrats et de protéines sont considerablée supérieur. En outre, afin d&#39;atteindre la milliseconde pour permettre une analyse de la réaction de synthèse de l&#39;amorce, on doit utiliser une machine à écoulement rapide trempe. <ol><li> Préparation des mélanges réactionnels. <ol><li> Préparer 400 pi de solution A, contenant un tampon 1x, 3 uM hexamère GP4, 6 uM ADNss modèle, 0,6 mM de dNTP, 1 mM CTP, et 2 nM [γ- 32 P] ATP. Préparer 400 pi de solution B, contenant 1 x tampon et 20 mM de MgCl 2. </li></ol></li><li> Le fonctionnement d&#39;écoulement rapide trempe <ol><li> Effectuer des réactions comme décrit dans l&#39;étape 2.2. Si on le désire, ajouter une ADN polymerase T7 ou une protéine de liaison à l&#39;ADN simple brin T7 à une concentration de 15 uM et 20 uM, respectivement. Dans ce cas, les produits d&#39;extension à l&#39;accumulation d&#39;un régime de temps qui permet le prélèvement manuel de la réaction. </li></ol></li></ol> Analyse 4. Données <ol><li> courbes de progression du produit Fit à MOINS AVANCES non linéairemodèles carrés en utilisant des logiciels disponibles dans le commerce capables de moindres carrés unique et / ou intégration numérique. Les détails de l&#39;opération varient avec le logiciel utilisé, mais au-dessous sont des formes généralisées d&#39;équations utilisées pour le montage des données. </li><li> Déterminer le taux de formation du produit de plusieurs réactions de synthèse d&#39;amorce rotation par ajustement des courbes de progression d&#39;une équation linéaire. S&#39;il y a une courbure importante, l&#39; utilisation de la méthode de la vitesse initiale 13, 14 en ajustant les données à une fonction mono-exponentielle: y = A (e - k t), où y est la concentration du produit, A est l&#39;amplitude de la réaction, k est la constante de vitesse observée, t est le temps, en secondes. La pente de la ligne tangente au temps = 0 est le taux initial. NOTE: Les réactions Fit pré-stables synthèse état d&#39;amorce à une équation linéaire ou à l&#39;équation d&#39;état pré-stable éclater y = A (e - k bupremière t) + taux ss t, où A est l&#39;amplitude de la réaction, k rafale est la constante de vitesse observée pour l&#39;éclatement de pré-état stationnaire, ss taux est l&#39;état stationnaire ss taux = k cat [Enzyme]), t est le temps , en secondes. Fit une seule rotation des réactions de synthèse de l&#39; amorce progressent courbes à une seule fonction exponentielle y = A (e - k t). Dans le cas de GP4, ajuster les données par intégration numérique 15, à un modèle avec trois NTP étapes de condensation, où chaque intermédiaire est en équilibre avec l&#39;enzyme, en utilisant un logiciel disponible dans le commerce. </li></ol>

<ol>
	<li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA replication. , (1992).</li><li>Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motors,+switches,+and+contacts+in+the+replisome.">Motors, switches, and contacts in the replisome.</a> Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).</li><li>Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+bacteriophage+T7+gene+4+proteins+in+providing+primase+and+helicase+functions+in+vivo.">Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).</li><li>Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+initiation+and+extension+by+T7+DNA+primase.">Primer initiation and extension by T7 DNA primase.</a> EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).</li><li>Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis.">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li><li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites.">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li><li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7.">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li><li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome.">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides.">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li><li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein.">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+primases.">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li><li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7.">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li><li>Cao, W., De La Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+full+time+course+analysis+of+nonlinear+enzyme+cycling+kinetics.">Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics.</a> Sci Rep. 3, 2658 (2013).</li><li>Wang, M. H., Zhao, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+determining+kinetic+constants+of+complexing+inactivation+at+identical+enzyme+and+inhibitor+concentrations.">A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations.</a> FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer.">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+enzyme+kinetic+analysis,+1913.">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li><li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG.">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).</li><li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery.">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Le facteur le plus important dans la réalisation de ces expériences est la disponibilité d&#39;enzyme purifiée très active. Au cours de notre travail avec GP4, par exemple, nous avons constaté que le stockage de l&#39;enzyme purifiée dans un tampon (20 mM de phosphate de potassium, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM) contenant 50% de glycerol à -20 ° C conduit à une diminution l&#39;activité spécifique de la préparation pendant quelques mois. Par conséquent, nous maintenant flash freeze petites aliquotes de GP4...

La réplication de l&#39;ADN est une caractéristique conservée de toute la vie cellulaire. Si l&#39;identité et le nombre de composants de réplication varient largement, les mécanismes généraux sont partagés entre l&#39; évolution 1. Ici, nous décrivons, des expériences cinétiques discontinues à base de gel, en utilisant des substrats radioactifs, visant à comprendre la cinétique de la synthèse d&#39;ADN calorifugeage brin in vitro par des composants du replisome T7. La machinerie de réplication du bactériophage T7 est très simple, ne comporte que quatre protéines (l&#39;ADN polymérase, GP5 et son facteur de processivité, E. coli , la thiorédoxine, le GP4 de primase-hélicase bifonctionnels, et la protéine de liaison à l&#39; ADN simple brin, GP2. 5) 2. Cette caractéristique en fait un système modèle attractif pour étudier les mécanismes biochimiques conservés impliqués dans la réplication de l&#39;ADN. L&#39;accent est mis sur la formation d&#39;amorces ribonucléotide par T7 DNA primase, un critical étape dans l&#39;initiation de la synthèse d&#39;ADN. En outre, on peut également étudier l&#39;utilisation de ces amorces par l&#39;ADN polymerase T7 ou d&#39;autres protéines de réplication en les incluant dans le mélange réactionnel. T7-primase de l&#39;hélicase, GP4, catalyse la formation d&#39;amorces pour la synthèse d&#39;ADN au niveau des séquences d&#39;ADN spécifiques appelés sites de reconnaissance primase, ou PRS (5&#39;-CG-3 &#39;). La cytosine dans la SRP est cryptique, il est essentiel pour la reconnaissance du site, mais il n&#39;a pas été copié dans le produit 3. La première étape dans la synthèse de l&#39; amorce par GP4 implique la formation du dinucléotide pppAC, qui est ensuite étendue à un trimère, et éventuellement des amorces tétranucléotidiques fonctionnels pppACCC, pppACCA ou pppACAC en fonction de la séquence dans le gabarit 4. Ces amorces peuvent ensuite être utilisées par l&#39; ADN polymerase T7 pour initier la synthèse de l&#39; ADN, qui est également un procédé assisté par GP4-5, 6. A cet égard, la primasedomaine stabilise les tetraribonucleotides extrêmement courts avec le modèle, ce qui empêche leur dissociation, engage l&#39; ADN polymérase d&#39;une manière favorable à la fixation de la amorce / matrice dans la polymérase du site actif 7. Ces étapes (synthèse de l&#39;ARN primaire, transfert intercellulaire primaire à la polymérase, et extension) sont répétées dans plusieurs cycles de reproduire le brin tardif et doivent être coordonnées avec la réplication du brin leader. Les dosages décrits ici sont très sensibles et peuvent être effectuées dans un laps de temps raisonnable. Cependant, ils sont relativement bas-débit et un grand soin doit être exercé dans l&#39;utilisation et l&#39;élimination des matières radioactives. En fonction de la vitesse à laquelle le produit de réaction, on pourrait employer un instrument rapide trempe pour atteindre des échantillons à des échelles de temps qui se prêtent à l&#39;analyse significative des cours de temps de réaction soit dans la constante ou l&#39;état pré-stable. Récemment, nous avons utilisé essais décrits ici pour fournir evidence de l&#39;importance de l&#39;amorce la libération du domaine primase de GP4 dans l&#39;initiation des fragments d&#39;Okazaki. De plus, nous avons trouvé la preuve d&#39;un rôle régulateur pour les protéines, de gp2.5 liant le T7 ADN simple brin, dans la promotion de la formation de l&#39; amorce et l&#39; utilisation efficaces 8.

<table><tbody><tr><td>Tris pre-set crystals&lt;br/&gt; pH 7.5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td><td>SIGMA</td><td>G1501&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>J.T. Baker</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>MP Biomedicals</td><td>811030</td><td></td></tr><tr><td>(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4931-04</td><td></td></tr><tr><td>[&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&amp;nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>four dNTPs part of set</td></tr><tr><td>100 mM ATP and CTP</td><td>Epicentre</td><td>RN02825</td><td>part of NTP set</td></tr><tr><td>ssDNA constructs</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>custom sequences&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>methanol&amp;nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>SIGMA</td><td>B8026&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cylene xyanol&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>X4126&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>acrylamide</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Methylenebisacrylamide</td><td>SIGMA</td><td>M7279&amp;nbsp;</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Quench-Flow Instrument&amp;nbsp;</td><td>Kintek Corp.</td><td>RQF-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Explorer</td><td>Kintek Corp.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph&amp;nbsp;</td><td>Synergy Software</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Les résultats présentés dans la figure 1A ont été obtenus comme décrit à l&#39; étape 1 du protocole, à savoir, en échantillonnant manuellement une réaction de synthèse de l&#39; amorce catalysée par GP4 dans des conditions multiples chiffre d&#39; affaires. Ici, une gamme de produits après électrophorèse en gel peut être observée en utilisant le CTP marqué avec 32P à l&#39;α-positionnement dans les réactions de ...

Watch this Scientific Journal Video about Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins at JoVE.com

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Cinétique de Lagging brin Synthèse de l&#39;ADN<em&gt; In vitro</em&gt; Par les protéines de réplication bactériophage T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

kinetics-lagging-strand-dna-synthesis-vitro-bacteriophage-t7

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Replication

SCIENTISTS IN ACTION

7.3K vues.  Harvard Medical School. We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7. 

Vidéo: Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. The binding of prokaryotic DnaG-like primases to DNA occurs at a specific trinucleotide recognition sequence. It is a pivotal step in the formation of Okazaki fragments. Conventional biochemical tools that are used to determine the DNA recognition sequence of DNA primase provide only limited information. Using a high-throughput microarray-based binding assay and consecutive biochemical analyses, it has been shown that 1) the specific binding context (flanking sequences of the recognition site) influences the binding strength of the DNA primase to its template DNA, and 2) stronger binding of primase to the DNA yields longer RNA primers, indicating higher processivity of the enzyme. This method combines PBM and primase activity assay and is designated as high-throughput primase profiling (HTPP), and it allows characterization of specific sequence recognition by DNA primase in unprecedented time and scalability.&#160;

Protein binding microarray (PBM) experiments combined with biochemical assays link the binding and catalytic properties of DNA primase, an enzyme that synthesizes RNA primers on template DNA. This method, designated as high-throughput primase profiling (HTPP), can be used to reveal DNA-binding patterns of a variety of enzymes.

Reconnaissance de séquence d'ADN par primase d'ADN utilisant le profilage primase à haut débit

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Recherche

Biochimie

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualisation de la réplication d&#39;ADN molécule unique par microscopie à fluorescence

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biologie

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Observation directe d&#39;ADN Enzymes réplication via un ADN simple molécule Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA polymerase (RNAP) following a head-on collision is unknown. Here, we find that the E. coli replisome stalls upon collision with a head-on transcription complex, but instead of collapsing, the replication fork remains highly stable and eventually resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. We also find that the transcription-repair coupling factor, Mfd, promotes direct restart of the fork following the collision by facilitating displacement of the RNAP. These findings demonstrate the intrinsic stability of the replication apparatus and a novel role for the transcription-coupled repair pathway in promoting replication past a RNAP block.

The fate of the replisome following a collision with a head-on RNA polymerase (RNAP) is unknown. We find that the replisome stalls upon collision with a head-on RNAP, but resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. Mfd promotes replication restart by facilitating displacement of the RNAP after the collision.

Redémarrez direct d&#39;une fourche de réplication bloquée par une polymérase ARN Head-On

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

Synthèse des bactériophages infectieuses dans un e. coli -basé système d’Expression acellulaire

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Bio-ingénierie

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

PCR quantitative du bactériophage T7 de criblage

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Immunologie et infection

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of oligonucleotides in biotechnology and synthetic biology. Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates have historically been prepared in vitro by enzymatic methods. However, these methods are limited to natural RNA oligonucleotides, have strong sequence preferences, and tend to produce heterogeneous products. New methods of chemical triphosphorylation complement both the reduced cost of automated oligonucleotide synthesis by phosphoramidite chemistry and the diverse range of nucleotide modifications now available. Thus, the synthesis of oligonucleotide triphosphates of arbitrary sequence and length, and optionally containing various nonnatural modifications, is now accessible.
This paper presents the appropriate methods and techniques for chemical triphosphorylation of oligonucleotides using salicyl phosphorochloridite and pyrophosphate. This method uses commercially available reagents, is compatible with most oligonucleotides prepared by standard solid-phase synthesis methods, and can be completed in 2 h following oligonucleotide synthesis, before deprotection and purification. Two uses of chemically triphosphorylated oligonucleotides as substrates for catalytic RNA enzymes are demonstrated, including the synthesis of a mirror-image version of the hammerhead ribozyme from nonbiological L-RNA triphosphates.

Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates are ubiquitous components in essential biological pathways and have seen increasing use in biotechnology applications. Here, we describe techniques for the routine synthesis and purification of oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates, starting from oligonucleotides prepared by standard automated synthesis techniques.

Triphosphorylation chimique des oligonucléotides

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

Exploration de la dynamique phage-bactérie intestinale dans des modèles murins à l’aide de phages T4

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across all known ecosystems. Within bacterial communities, such as those found in the gut microbiota, phages are implicated in regulating microbiota population dynamics and driving bacterial evolution. There has been renewed interest in phage research in the last decade, in part due to the host-specific killing capabilities of lytic phages, which offer a promising tool to counter the increasing threat of antimicrobial resistant bacteria. Furthermore, recent studies demonstrating that phages adhere to intestinal mucus suggest they may have a protective role in preventing bacterial invasion into the underlying epithelium. Importantly, like bacterial microbiomes, disrupted phageomes have been associated with worsened outcomes in diseases such as inflammatory bowel disease. Previous studies have demonstrated that phages can modulate the microbiome of animals and humans through fecal filtrate transplants, benefiting the host&#39;s health. With this recent wave of research comes the necessity to establish and standardize protocols for studying phages in the context of the gut microbiome. This protocol provides a set of procedures to study isolated T4 phages and their bacterial host, Escherichia coli,&#160;in the context of the murine gastrointestinal tract. The methods described here outline&#160;how to start from a phage lysate, administer it to mice and assess effects on bacterial host and phage levels.&#160;This protocol can be modified and applied to other phage-bacterial pairs and provides a starting point for studying host-phage dynamics in vivo.

Pleins feux sur l’auteur : Étude des réponses immunitaires induites par les bactériophages chez les souris gnotobiotiques

Bacteriophages (phages), viruses that infect bacteria, are an integral component of the gut microbiome. Though these symbiotic inhabitants drive bacterial fitness and population dynamics, little is understood about how they impact gut homeostasis and disease. This protocol studies isolated T4 phages within a mouse model, adaptable to other phage-bacterial pairs.

Interaction entre le bactériophage T4 et E . coli dans l’intestin murin : un modèle prototypique pour l’étude de la dynamique hôte-bactériophage in vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

Cinétique de Lagging brin Synthèse de l'ADN

Résumé

Explorer plus de vidéos

Chapitres dans cette vidéo

Reconnaissance de séquence d'ADN par primase d'ADN utilisant le profilage primase à haut débit

Visualisation de la réplication d'ADN molécule unique par microscopie à fluorescence

Observation directe d'ADN Enzymes réplication via un ADN simple molécule Stretching Assay

Redémarrez direct d'une fourche de réplication bloquée par une polymérase ARN Head-On

Synthèse des bactériophages infectieuses dans un e. coli -basé système d’Expression acellulaire

PCR quantitative du bactériophage T7 de criblage

Triphosphorylation chimique des oligonucléotides

Interaction entre le bactériophage T4 et E . coli dans l’intestin murin : un modèle prototypique pour l’étude de la dynamique hôte-bactériophage in vivo

Interaction entre le bactériophage T4 et E . coli dans l’intestin murin : un modèle prototypique pour l’étude de la dynamique hôte-bactériophage in vivo

Interaction entre le bactériophage T4 et E . coli dans l’intestin murin : un modèle prototypique pour l’étude de la dynamique hôte-bactériophage in vivo