Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine des microARN, en fournissant des outils pour détecter la lcalisation relative des molécules de protéines et de microARN. Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez détecter à la fois des molécules de protéines et de microARN à partir de la même section tissulaire. Ce protocole commence par une réhydratation des tissus montés sur diapositives.
Réchauffez les toboggans à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes dans le four d’hybridation. La paraffine devrait fondre visiblement. Ensuite, incubez les glissières dans un bocal coplin en verre contenant un agent de compensation disponible dans le commerce pendant 10 minutes.
Fais ça deux fois. Ensuite, transférez les diapositives du lavage au lavage pour réhydrater les tissus. Une fois hydratés, incuber les tissus dans proteinase K solution de travail à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Pour enlever la proteinase K, lavez les glissières en 1x PBS deux fois. Maintenant, réparez les tissus. Tout d’abord, faire des réservoirs sur les diapositives à l’aide d’un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle hydrofuge autour des préparations.
Ensuite, appliquez 500 microlitres de solution PFA à 4 % à l’intérieur de la barrière et incubez les glissières dans un capot de fumée. Pour enlever le fixatif, lavez les glissières dans un bocal Coplin contenant du PBS pendant cinq minutes deux fois à température ambiante. Ensuite, lavez les diapositives en 0,13 molaire 1-Méthylimidazole pendant 10 minutes.
Faites ceci dans le capot de fumée à la température ambiante, et exécutez ce lavage deux fois. Ajouter le fixatif EDC et incuber à température ambiante dans un capot de fumée pendant une heure. Rincez les toboggans avec des tris de 50 millimolaires.
Pour se préparer à l’hybridation, construisez d’abord une chambre humidifiée. Chargez deux morceaux de filtre ou de papier de soie dans le fond d’une boîte, et mouillez le papier avec un mélange uni-à-un de formamide et 1x SSC. Ensuite, appliquez 200 microlitres de solution d’hybridation préchauffée à chaque glissière et incubez la chambre humidifiée des toboggans pendant une à trois heures à 50 degrés Celsius.
Après l’incubation, remplacez la solution d’hybridation par 250 microlitres de solution de sonde et couvrez les glissières d’un glissement de couvercle sans RNase. Essayez d’éviter de piéger les bulles d’air sous le bordereau de couverture. Maintenant, scellez soigneusement la chambre avec du parafilm, et incuber les glissières pendant la nuit à environ 30 degrés Celsius au-dessous de la température de fusion de l’ARN de la sonde.
L’optimisation peut être nécessaire. En plus de fixer la bonne température d’incubation, différents microARN sont exprimés à différents niveaux, de sorte que l’optimisation concernant la concentration de la sonde peut également être nécessaire pour obtenir le signal optimal. Après l’hybridation, effectuez les lavages de corde.
Tout d’abord, était en 2x SSC à 50 degrés Celsius pendant cinq minutes, ou jusqu’à ce que le couvercle glisse desserrer. Ensuite, effectuez deux lavages en 2x SSC à température ambiante, chacun pendant cinq minutes. Puis, en continuant à température ambiante, laver les glissières pendant cinq minutes en 0,2 x SSC, suivie de cinq minutes en PBST, et enfin, cinq minutes en 1x PBS.
À ce stade, les hybrides ARN-ARN sont stables, et les conditions strictes en ARN ne sont plus nécessaires. Pour la détection des anticorps DIG, tout d’abord, retouchez les barrières hydrophobes et appliquez 500 microlitres de solution de blocage pendant trente minutes. Incuber les glissières à température ambiante dans une chambre humidifiée.
Ensuite, retirez la solution de blocage et remplacez-la par 500 microlitres de solution d’anticorps DIG. Incuber les glissières à température ambiante dans une chambre humidifiée pendant une heure. Ensuite, à l’aide de bocaux Coplin, lavez les glissières trois fois en PBST pendant cinq minutes par lavage.
Ensuite, lavez les glissières dans la solution de pré-coloration pendant cinq minutes deux fois. Ensuite, transférez les glissières dans un bocal d’expéditeur de glissière en polypropylène et ajoutez 20 millilitres de solution de substrat AP. Maintenant, incuber les toboggans à 37 degrés Celsius pendant six à 24 heures, à l’abri de la lumière.
Lorsque vous utilisez d’abord le substrat AP, il est important de suivre la réaction. À intervalles de deux heures, vérifiez le développement des couleurs sur les diapositives à l’aide d’un microscope, jusqu’à ce qu’un temps d’incubation optimal ait été déterminé. Pour enlever l’excès de substrat AP, lavez les glissières deux fois dans la solution KTBT pendant cinq minutes par lavage, suivies d’un lavage en PBS pendant cinq minutes.
Pour détecter l’anticorps cTNT, d’abord, bloquer les tissus pendant une heure. Ensuite, appliquez 200 microlitres de solution d’anticorps cTNT, et incubez les glissières pendant la nuit à 4 degrés Celsius dans une chambre humidifiée. Le lendemain, lavez les glissières dans un bocal Coplin contenant du PBS pendant cinq minutes.
Fais ça trois fois. Ensuite, appliquez 250 microlitres de solution anticorps anti-lapin 568, et incuber les glissières pendant une heure à température ambiante dans une chambre humidifiée. Pour laver l’excès d’anticorps secondaire, utilisez trois lavages de cinq minutes dans PBS.
Ensuite, si désiré, appliquez 250 microlitres de la solution de travail DAPI, et incuber les diapositives pendant une minute, à l’abri de la lumière. Pour enlever l’excès de tache DAPI, utilisez deux lavages PBS de cinq minutes et, après les lavages, montez les glissières. L’hybridation in situ de MicroRNA a été optimisée sur des sections de coeur de souris utilisant un microARN brouillé pour le contrôle négatif, et un SnRNA de U6 comme contrôle positif.
L’expression cardiomyocyte-spécifique du microARN-182 a été évaluée dans les sections de coeur des souris témoins et plgf-surexprimantes. Les souris ont porté un transgène de PlGF sous un promoteur d’alpha-MHC, et ont développé l’hypertrophie cardiaque, secondaire à l’angiogenèse accrue, dans les six semaines de l’activation transgénique. Le protocole de coloration a indiqué l’expression accrue du microARN-182 dans les coeurs des souris de PlGF.
Ensuite, pour déterminer quels types de cellules ont exprimé le microARN-182, les mêmes sections ont été immunotachées pour le cTNT. La coloration DAPI a également été utilisée. Dans les sections de coeur de souris de contrôle et de PlGF, le microARN-182 a été trouvé dans le compartiment nucléaire des cellules cardiomyocytes cTNT-positives.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’hybridation microRNAse, suivie par l’immunostaining des protéines. Tout en essayant cette procédure, il est très important de se rappeler de garder des conditions RNAse-libre tout au long de la première journée, pendant toutes les étapes menant à l’hybridation prop. Après cette procédure, d’autres méthodes comme la tache occidentale dans un PCR en temps réel peuvent être effectuées pour répondre à des questions comme, quels sont les niveaux d’expression relatifs de ce microARN particulier dans différents tissus, ou cette protéine particulière dans la même section tissulaire.
N’oubliez pas que travailler avec des fixatifs tels que PFA et ADC peut être extrêmement dangereux. Les précautions, y compris le port de gants et de blouses de laboratoire, ainsi que l’utilisation de hottes de fumée, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
