Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine du chloroplaste, par exemple, la composition des machines d’importation de protéines chloroplastes. Il est essentiel pour le verdissement et la photosynthèse et donc pour la production alimentaire sur la planète. La machine moléculaire se compose de deux complexes distincts dans le membre externe et intérieur du chloroplaste appelé TOC et TIC, mais la composition n’est pas entièrement connue.
Le principal avantage de cette technique est que la purification du complexe Arabidopsis TOC/TIC peut être accomplie en une seule étape méthode de purification, la purification TAP-TOC. C’est une méthode spécifique et efficace. En général, les chercheurs nouveaux à cette méthode peuvent lutter parce qu’ils ne sont pas familiers avec l’isolement des fractions de membrane chloroplaste, détergent, solubilization, ou purification d’affinité.
Après avoir préparé les plantes arabidopsis, moudre 10 grammes de semis de trois semaines dans de l’azote liquide, à l’aide d’un mortier froid et pilon avec du sable. Ajouter 20 millilitres de tampon de broyage à froid aux tissus du sol. Bien mélanger et laisser le mélange décongeler sur la glace.
Ensuite, trempez deux couches de matériau de filtration rapide avec tampon de broyage. Filtrer l’homogénéité à travers les deux couches de matériau de filtration dans un tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres. Centrifugez le filtrate à 1500 fois g en quatre degrés Celsius pendant 10 minutes et transférez le supernatant dans un tube de centrifugeuse conique frais et pré-refroidi de 50 millilitres.
Répétez la centrifugation une fois de plus dans les mêmes conditions. Transférer le supernatant dans un tube d’ultracentrifugeuse froid de 38,50 millilitres et le recharger jusqu’à 35 millilitres avec tampon de broyage à froid. Utilisez une ultracentrifugeuse pour centrifuger l’échantillon à 100 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant une heure.
À l’aide d’un homogénéisateur en téflon en verre, réutilisez la pastille verte dans un tampon de broyage. Centrifugeuse à 100 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant une heure et jeter le supernatant. Utilisez l’homogénéiseur en verre téflon pour résuspendre la pastille verte dans 18,75 millilitres d’un tampon de broyage x.
Ajouter ensuite 9,375 millilitres d’un tampon de broyage x. Ajouter 9,375 millilitres de quatre x solution de solubilisation pour porter le volume final à 37,5 millilitres et incuber sur un shaker rotatif à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après cela, utilisez une ultracentrifugeuse pour centrifuger l’échantillon à 100 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant une heure.
Transférer le supernatant contenant les membranes solubilisées dans un tube de centrifugeuse conique frais de 50 millilitres. Après avoir préparé la résine d’agarose IGG, transférez la résine d’agarose IGG précédemment lavée au tube conique de 50 millilitres contenant les 37,5 millilitres de membranes solubilisées. Incuber pendant la nuit sur un shaker rotatif à quatre degrés Celsius.
Le lendemain, sédimenter la résine agarose IGG à 100 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Utilisez une pipette pour enlever le surnatant. Était la résine agarose IGG dans 37,5 millilitres de tampon A et incuber sur un shaker rotatif à température ambiante pendant 10 minutes.
Continuer à sédimenter et laver la résine comme indiqué dans le protocole de texte. Après cela, transférer la résine agarose IGG à une colonne de spin de 500 microlitres avec un filtre de 35 microns. Lavez les perles deux fois avec 300 microlitres de tampon d’élitution TEV pour l’équilibrage.
Ensuite, ajoutez 300 microlitres de tampon d’élitution TEV contiennent 10 microlitres de protéase TEV. Incuber la colonne de spin avec des perles dans un Thermomixer à 16 degrés Celsius et 350 tours pendant deux heures. Ensuite, ouvrez la colonne de spin et placez-la dans un nouveau tube propre de 1,5 millilitre.
Faites tourner ce tube à 100 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour recueillir l’allongement. Dans cette étude, un complexe protéique d’enveloppe de chloroplaste tagué tap des usines transgéniques d’A.thaliana est purifié. L’analyse d’Immunoblot confirme que l’isolat TAP-TOC159 interagit avec TOC75 et TOC33 du complexe TOC.
La kinase de membrane externe de chloroplaste, KOC1, qui est connue pour phosphorylate TOC159 est également co-isolée. La présence de TIC110 révèle que le complexe isolé TAP-TOC159 contient également les composants du complexe TIC. L’anticorps FBN1A n’a pas reconnu le complexe TAP-TOC159, ce qui indique l’absence de contaminations.
Dans le contrôle négatif, la protéine NTAP immunoprécipitée ne s’est co-isolée avec aucune des protéines TOC, TIC et confirme la spécificité de la purification TAP-TOC159. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’importation de protéines chloroplastes, elle peut potentiellement être appliquée à tout autre complexe dans le système de bouteilles arabidopsis thaliana. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes peuvent être appliquées, comme le ballonnement occidental ou la spectrométrie de masse, soit pour démontrer la présence de composants connus, soit pour identifier de nouveaux composants des complexes TOC et TIC.
Cette technique a ouvert la voie à la recherche dans le domaine de l’importation de protéines chloroplastes afin d’explorer la fonction des nouveaux composants des complexes TOC et TIC.
