Cette vidéo fournira des protocoles détaillés pour les expériences de forme in vitro afin de déterminer la structure secondaire des séquences d’ARN d’intérêt en présence d’un ARN ciblant une petite molécule. La forme in vitro est une méthode rentable pour comprendre la dynamique de chaque nucléotide sur un élément arn de la taille d’un aminé qui est généralement inférieur à 200 nucléotides. Après avoir préparé le modèle d’ARN tel que décrit dans le manuscrit, l’étiquette radio amorce la transcription inverse en ajoutant un gamma 32P ATP, amorce de transcription inversée.
Tampon de réaction 10XPNK, kinase polynucléotide et eau libre de l’ARN dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre dans un volume total de 20 microlitres. Puis incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Vous activez ensuite les échantillons pendant 20 minutes depuis 65 degrés Celsius, puis filtrez les échantillons dans une colonne de desalting et centrifugeuse à 1000 fois G.Ajouter 25 microlitres de tampon échantillon d’urée 2XTBE et mélanger.
Abaissez ces produits étiquetés dans un gel d’acrylamide à 10 % et assurez-vous d’éviter de saigner la radioactivité dans les réservoirs du haut. Faire fonctionner le gel à 20 watts pendant une heure. Après la course, retirer les plaques de verre de la cassette de gel.
Déposer le gel sur le morceau de pellicule plastique. Pliez le plastique sur le dessus du gel pour faire un sandwich étanche à l’air. Déposer le sandwich au gel sur un écran de phosphore calcium-tungstate et exposer à l’aide d’un instrument d’imagination.
Imagez le gel à nouveau avec la lumière régulière pour savoir où sont les bords du gel. Utilisez un logiciel de traitement d’image pour superposer les deux images et superposer les images claires et sombres. Ensuite, rendre l’image supérieure légèrement opaque afin de voir les deux images simultanément.
Assurez-vous que l’image imprimée a la même taille que le gel réel. Alignez ensuite le gel sur l’image imprimée. Enfin, utilisez une lame de rasoir stérilisée pour couper les plis désirés du gel et placer chaque morceau de gel dans un tube de microcentrifugeuse séparé de 1,7 millilitre.
Pour récupérer l’ADN de la tranche de gel par elution passive, ajoutez 0,3 millilitres de mélange de précipitations d’élitution à chaque tube de 1,7 millilitre. Incuber les tubes dans un récipient radioactif sûr sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Après l’incubation, transférer le liquide dans un nouveau tube de 1,7 millilitre.
Ajouter 2,5 x de glace froide 200 éthanol à l’épreuve et inverser les tubes six fois pour mélanger le liquide. Incuber les tubes à moins 80 degrés Celsius pendant au moins une heure. Après avoir centrifugé à 10 000 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, retirez soigneusement le supernatant par pipetting.
Ajouter un millilitre de 80 % d’éthanol pour laver la pastille. Vortex pendant 15 secondes et centrifugeuse à nouveau dans les mêmes conditions. Après avoir enlevé le supernatant par pipetting, sécher à l’air la pastille d’ADN pendant cinq minutes.
Ajouter 50 microlitres d’eau libre de l’ARN et mélanger en pipetting de haut en bas 10 fois. Normaliser la concentration d’ADN à environ 100 000 dénombrements par minute par microlitre dans un compteur de scintillation. Pour préparer quatre échantillons à la modification chimique, ajouter huit picomoles d’ARN dans 32 microlitres de tampon de 0,5 XTE à un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre.
Chauffer à 80 degrés Celsius pendant deux minutes et laisser refroidir sur la glace pendant au moins une minute. Ajouter ensuite huit microlitres de mélange pliant 5x, mélanger un allouer neuf microlitres de ce mélange d’ARN dans chacun des quatre tubes PCR, étiquetés de un à quatre. Ajouter un microlitre de 10% DMSO dans le tube marqué comme un, un microlitre de solution concentrée de petite molécule dans le tube deux, un microlitre de solution diluée de petite molécule dans le tube trois et un microlitre d’eau dans le tube quatre.
Incuber tous les tubes PCR à 37 degrés Celsius dans un cycleur thermique pendant 30 minutes. Directement avant la réaction de modification de deux oh premier, diluer un microlitre de deux solution molaire de stock de NAI dans trois microlitres de l’eau DEPC-traitée pour produire une solution de travail molaire de 0,5. Ajoutez immédiatement un microlitre de cette solution dans les tubes un, deux et trois.
Ajouter un microlitre de 25% DMSO dans le tube quatre et incuber dans un cycleur thermique à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Préparer quatre tubes de microcentrifugeuse frais de 1,7 millilitre et ajouter 100 microlitres de mélange de précipitations d’élitution et deux microlitres de glycogène à chaque tube. Puis dans chacun de ces tubes transférer tout le liquide à partir des tubes PCR correspondants.
Ajouter 0,34 millilitres d’éthanol glacé à l’épreuve 200 dans chaque tube et mélanger en tourbillonnant pendant cinq secondes. Placez les tubes dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius pendant au moins une heure. Puis centrifuger les tubes pendant 15 minutes à 14 000 fois G à quatre degrés Celsius.
Sans déranger la pastille d’ARN, retirez le surnatant de chaque tube. Ajouter 0,5 millilitres de 80 % d’éthanol par tube pour laver la pastille d’ARN et le vortex pendant 15 secondes. Après avoir centrifugé à nouveau dans les mêmes conditions, retirer le supernatant et sécher à l’air la pastille d’ARN pendant cinq minutes.
Ajouter neuf microlitres d’eau libre et de tuyaux d’ARN qui montent et descendent 10 fois pour mélanger. Transférez l’ARN modifié dans quatre nouveaux tubes PCR et étiquetez-les un à quatre comme dans l’étape précédente. Ajoutez deux picomoles d’ARN dans sept microlitres d’eau traitée par DEPC à chacun des quatre tubes PCR supplémentaires et étiquetez-les avec des nombres cinq à huit.
Ajouter deux microlitres de l’amorce radioétique récupérée à chacun des huit tubes PCR marqués un à huit. Après avoir chauffage à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes, refroidir immédiatement à quatre degrés Celsius dans le cycleur thermique. Ajouter quatre microlitres de tampon RT 5x, un microlitre de 0,1 molaire DTT et un microlitre de mélange DNTP à chacun des tubes.
Ajouter ensuite deux microlitres d’eau traitée par DEPC aux tubes un à quatre. Ajouter quatre microlitres de cinq millimolaires ddATP au tube cinq, quatre microlitres de cinq millimolaires ddTTP au tube six et quatre microlitres de cinq millimolaires ddCTP au tube sept et un microlitre de cinq millimolaires ddGTP et trois microlitres d’eau traitée par DEPC à tube huit et pipette quatre fois à mélanger. Après avoir chauffage tous les tubes PCR à 52 degrés Celsius pendant une minute dans un cycleur thermique, ajouter un microlitre de transcriptase inverse à chaque tube et le pipe de haut en bas quatre fois pour mélanger.
Incuber les réactions à 52 degrés Celsius pendant 20 minutes dans le cycleur thermique. Pour hydrolyser l’ARN, ajouter un microlitre de cinq hydroxyde de sodium molaire dans chacun des tubes et les chauffer à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite cinq microlitres d’un acide chlorhydrique molaire pour neutraliser la réaction et répéter les précipitations d’éthanol comme décrit précédemment.
Après séchage à l’air de la pastille d’ADN pendant cinq minutes, ajouter 10 microlitres d’eau et 10 microlitres de tampon de chargement de l’échantillon d’urée 2xTBE dans des tubes de 1,7 millilitre et le pipe de haut en bas 10 fois pour redissolent. Chauffer les échantillons à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis placer les tubes sur la glace, avant de les charger sur le gel. Chargez 10 microlitres de l’échantillon qui a été placé sur la glace sur le gel de séquençage en polyacrylamide à 8 %.
Faire fonctionner le gel à 65 watts pendant deux heures ou jusqu’à ce que le colorant inférieur atteigne les 3/4èmes du gel. Retirez l’espaceur et insérez doucement une spatule pour enlever la plaque de verre siliconée supérieure. Couvrir le gel d’un morceau de papier filtre grand et presser doucement pour permettre au gel d’adhérer au papier filtre.
À partir de l’extrémité inférieure, soulevez le papier filtre et retirez le gel de la plaque de verre avec le papier. Après avoir transféré le gel sur un papier d’emballage comme précédemment fait, le sécher à 70 degrés Celsius pendant une heure avec un vide, en s’assurant d’utiliser plusieurs papiers filtre entre le gel et la sécheuse. Transférez le sandwich au gel sur une cassette d’écran de stockage de phosphore blanchie par photo et exposez la radioactivité du gel à l’écran pendant quatre à 16 heures.
Enfin, placez l’écran de stockage du phosphore sur un appareil d’imagerie et numérisez à résolution moyenne pendant environ 30 minutes. Après avoir exposé le gel de séquençage de polyacrylamide à l’écran de stockage de phosphore, une expérience réussie de forme a montré une courbure simple et la plus intense au dessus du gel et se plie tout au long du gel à la résolution simple de nucléotide sans frottis. Le gel a également montré que l’intensité de certains virages a changé en présence de petites molécules, ce qui indique des changements de la force d’appariement de base.
Un problème courant dans l’analyse de page est qu’une région de frottis connue sous le nom de front de sel peut apparaître au milieu du gel, probablement en raison de la concentration élevée de sel, de DMSO ou d’autre substance indésirable dans l’échantillon de chargement. Cela peut être évité en enlevant la substance indésirable par précipitation d’éthanol. Un modèle d’ARN homogène est préférable pour la forme in vitro.
Nous utilisons des ribosomes à la fois à cinq extrémités principales et trois extrémités principales pour obtenir un tel ARN. La forme dans la cellule peut également être exécutée pour obtenir la structure secondaire d’ARN dans le contexte cellulaire. N’oubliez pas que la forme in vitro peut ne pas récapituler les interactions protéiques liant l’ARN vivo.
La forme in vitro est une méthode puissante pour détecter les changements dans la structure de l’ARN en raison de la présence d’une petite molécule. Ceci est fait en quantifiant les changements dans la force de modelage des arrêts de transcriptase inverse. Soyez prudent que toutes les expériences décrites dans cette vidéo soient effectuées dans un lieu de travail radioactif autorisé avec une protection personnelle appropriée et un blindage en plexiglas.
