Cette méthode adapte le protocole de culture métatarsienne aux os plus gros, permettant de combiner la manipulation osseuse directe avec des modèles génétiques complexes pour traiter les processus liés au développement osseux. Cette technique permet la manipulation et l’analyse de la croissance osseuse qui ne sont pas possibles in vivo, comme l’imagerie en direct ou la manipulation physique et pharmacologique directe. Cette méthode de culture ex vivo permet l’étude spécifique des effets locaux de l’encart génétique dans l’os le séparant de l’effet systémique du traitement sur l’organisme.
Commencez par stériliser la région abdominale d’un jour gestationnel enceinte 14,5 à 18,5 souris avec 80% d’éthanol et en utilisant de petits ciseaux pour ouvrir la peau et les muscles abdominaux pour accéder aux cornes utérinnes. Pour extraire l’utérus de la cavité abdominale, retirez le mésometrium et coupez la base des cornes. Ensuite, transférez l’utérus dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant un milieu de dissection glacé sur la glace.
Dans une armoire de biosécurité coupée entre les sacs avec des ciseaux pour séparer les fœtus individuels, et transférer un sac individuel dans un nouveau plat de 60 millimètres avec milieu de dissection fraîche sous un microscope stéréo dissection. Utilisez des pinces à épiler pour séparer les fœtus des placentas et nettoyer les fœtus des membranes. Utilisez une pipette en plastique parée pour transférer le corps dans un nouveau plat de 60 millimètres et décapiter l’embryon avant d’autres dissections.
Ensuite, utilisez des pinces à épiler pour enlever la peau, à partir du dos et l’épluchage vers les ateils. Utilisez la pince à épiler pour couper près de la colonne vertébrale et séparer les membres postérieurs du corps. Transférez les membres postérieurs dans un plat propre contenant un milieu de dissection glacé et insérez les pinces entre le cartilage de surface du fémur distal et le tibia proximal pour séparer le tibia du fémur.
Retirer les os de la hanche du fémur proximal et l’os du calcanée et le péroné du tibia. Pincez soigneusement et tirez les tissus mous des fémurs et des tibias et utilisez une pipette stérile d’un millilitre pour transférer les quatre os de jambe dans le premier puits d’une plaque de 24 puits contenant le milieu frais de dissection. Il est important de montrer que le tissu mou qui relie le pouls de l’os est enlevé.
Sinon, l’os se pliera et n’atteindra pas la croissance appropriée. Lorsque les os ont été disséqués à partir du nombre expérimental approprié de fœtus, imagez les os dans chaque puits parfois zéro sous un microscope léger avec un bon contraste et remplacez le milieu de dissection dans chaque puits par un millilitre de milieu de culture par puits en prenant soin de ne pas aspirer les os. Pour observer l’effet de l’inhibition de croissance dans les conditions de culture, traitez les tibias gauches avec l’acide rétinoïque nanomolaire de 500 nanomolar et incubez les tibias droit avec un volume équivalent de véhicule comme contrôle.
Ensuite, placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire dans des conditions standard de culture cellulaire. Après deux jours, traiter les os avec un analogue approprié de thymidine pendant une à deux heures pour évaluer la prolifération de cellules d’os avant de transférer les os aux tubes individuels de deux millilitres de 4% paraformaldéhyde pendant 10 minutes. Ensuite, transférez les os à PBS pour l’image des os au point de temps final avant de retourner les échantillons au paraformaldéhyde pour la fixation de nuit à quatre degrés Celsius.
Pour mesurer la longueur et la région minéralisée des os, ouvrez un logiciel d’imagerie approprié, et en tenant compte de l’échelle de l’image, mesurez à la fois la longueur totale de l’os et la région minéralisée. Démarrage des mesures à partir des premières cellules sombres à une extrémité jusqu’aux dernières cellules sombres à l’autre extrémité. Pour calculer le taux de croissance qui est défini comme l’augmentation moyenne de la longueur par jour, répartir la différence entre la longueur finale de l’os et la longueur initiale par le nombre de jours en culture.
Ici, une comparaison entre le tibia cultivé et le tibia fraîchement extrait à des stades équivalents est montrée. Après jusqu’à deux jours de culture, la taille atteinte est comparable à la croissance osseuse in vivo pour le cartilage et l’os minéralisé. De plus longues périodes de culture conduisent à de plus grandes différences entre les os cultivés et les os fraîchement extraits.
Notez que le tibia cultivé avec un ablation incomplète du tissu mou peut entraîner une flexion du tibia cultivé. Le traitement à l’acide rétinoïque a un effet robuste sur la croissance tibiale dès après deux jours de traitement. Bien qu’il y ait une augmentation constante de la longueur totale du tibia après deux jours dans la culture, cette croissance correspond à une augmentation approximative de seulement neuf à 29% de la longueur initiale.
Moins que l’augmentation de la croissance osseuse qui serait observée in vivo. En effet, l’étiquetage analogique de thymidine montre moins de cellules positives dans cette région après culture comparées aux os fraîchement extraits d’un stade équivalent. En outre, dans le tibia cultivé in vitro, la longueur totale de l’élément squelettique augmente considérablement, tandis que presque aucune augmentation dans la région minéralisée n’est observée.
En plus de l’analyse histologique et moléculaire, la compensation et l’imagerie 3D peuvent être effectuées après la culture pour caractériser l’effet cellulaire des traitements appliqués aux os cultivés. Cette technique nous permet d’aborder les questions liées à la communication interorganique. Par exemple, en co-culture des os des différents modèles génétiques dans une sorte d’expérience de parabiosis sans douleur.
