Ce protocole permet à un chercheur d’identifier les anémones de mer mutantes au cours de l’embryogenèse précoce afin que le phénotype développemental post-embryonnaire puisse être analysé. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour génotyper les anémones de mer individuelles au début de l’ontogenèse sans sacrifier la vie de l’animal. Miguel Silva, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera cette procédure.
La veille de l’induction du frai, placez l’anémone nematostella vectensis dans un incubateur à température et à commande lumineuse, programmant l’incubateur de sorte que les animaux soient exposés à huit heures de lumière à 25 degrés Celsius. Le lendemain, retirez les animaux de l’incubateur et laissez-les sur un banc à température ambiante avec la lumière allumée pour permettre le frai, qui se produira dans les une heure et demie à deux heures suivantes. Utilisez une pipette de transfert dont la pointe est coupée pour agrandir l’ouverture pour placer les paquets d’ovules du récipient femelle dans un récipient mâle contenant du sperme et les laisser dans le récipient masculin pendant au moins 15 minutes pour permettre la fécondation.
Après la fécondation, pour dejelly les paquets d’oeufs, placez-les dans l’eau de mer contenant 3% de cystéine sur une boîte en verre de Petri et agitez doucement sur un shaker pendant 12 minutes. Ensuite, briser les touffes avec une pipette en plastique et continuer à agiter pendant encore deux à trois minutes jusqu’à ce que complètement dejellied. Gardez les œufs fécondés sur le même plat à 16 degrés Celsius ou à température ambiante.
Le lendemain, préparez un tampon d’extraction d’ADN tel que décrit dans le manuscrit, mélangez bien par vortex, et aliquot dans les tubes PCR en ajoutant 20 microlitres à chaque tube. Dissoudre 1% d’agarose dans l’eau de mer, la verser dans une boîte de Pétri pour couvrir le fond, et refroidir sur un dessus de banc pour faire un lit de gel. Couvrir le lit de gel d’eau de mer fraîche.
Transférer des embryons post-fécondation 24 heures sur 24 à l’aide d’une pipette dans la boîte de Pétri contenant du gel d’agarose. Insérez une aiguille de tungstène dans un support de besoin et stérilisez en plongeant sa pointe dans l’alcool et en la plaçant en flammes pour brûler l’alcool. Sous un microscope disséquant, faire une dépression sur l’agarose en utilisant l’aiguille de tungstène pour enlever un morceau de surface agarose sur la taille d’un embryon à manipuler.
Ensuite, à l’aide de l’aiguille de tungstène, placez l’embryon dans la dépression avec son côté latéral orienté vers le bas afin de limiter le mouvement de l’embryon pour la microchirurgie. Afin d’effectuer une chirurgie réussie, il est essentiel de restreindre le mouvement de l’embryon. Avec l’aiguille de tungstène, enlever chirurgicalement un morceau de tissu aboral le long de l’axe aboral oral, situé en face de l’ouverture blastoporale orale.
À l’aide d’une pipette P20, transférer le tissu aboral isolé dans un tube PCR contenant 20 microlitres de tampon d’extraction d’ADN. Transférer l’embryon post-chirurgie dans un puits d’une plaque de 24 puits contenant au moins 500 microlitres d’eau de mer fraîche. Et placez la plaque contenant des embryons post-chirurgie dans un incubateur à 16 degrés Celsius jusqu’à ce que le génotypage soit terminé.
Pour extraire l’ADN génomique d’embryons simples, faites d’abord brièvement tourner les tubes PCR contenant le tampon d’extraction de l’ADN et les tissus embryonnaires isolés à l’aide d’une mini centrifugeuse. Puis incuber les tubes à 55 degrés Celsius pendant trois heures tout en tourbillonnant pendant 30 secondes toutes les 30 minutes pour assurer la rupture des touffes cellulaires et améliorer la lyse cellulaire. Après avoir inactivé proteinase K à 95 degrés Celsius pendant quatre minutes, mettre en place une réaction PCR en utilisant l’ADN génomique extrait comme un modèle pour amplifier le lieu d’intérêt.
Concevoir les amorces désirées telles que décrites dans le manuscrit. Configurer une réaction PCR de 20 microlitres. Après avoir terminé pcr, exécuter électrophoresis gel agarose pour déterminer la taille et la présence ou l’absence de produits PCR, en s’assurant d’ajuster l’état de gel agarose électrophoresis en fonction de la taille prévue des produits PCR.
Utilisez les résultats pcr concernant la taille et la présence ou l’absence ou les produits PCR pour attribuer un génotype à chaque embryon post-chirurgical, puis trier les embryons en fonction de leur génotype. Le génome de la nématostella a un seul locus qui code une protéine précurseur pour le neuropeptide, GLWamide. Trois allèles mutants knockout au locus ont été précédemment rapportés.
Les résultats de PCR des embryons aléatoirement échantillonnés parmi la progéniture d’un croisement de F1 entre une femelle hétérozygote portant un allèle de KO d’A et les mâles hétérozygotes portant un allèle de KO de C montrent différents génotypes. Les embryons un et deux montrent une seule bande PCR correspondant à la taille prévue d’un allèle knockout. Embryons trois et six montrent deux bandes PCR avec les tailles prévues pour les allèles KO A et C.Embryos quatre, sept et huit montrent une seule bande PCR correspondant à la taille prévue de C knockout allèle.
L’embryon 5 ne montre aucune bandes, suggérant l’absence de liaison d’amorce. Pour écarter la possibilité d’une défaillance de l’extraction de l’ADN génomique, un autre PCR a été exécuté à l’aide d’une amorce inverse qui peut se lier à la séquence de type sauvage. Lorsqu’un produit PCR d’une taille prévue a été détecté, l’extraction de l’ADN génomique a été couronnée de succès.
Alors qu’aucun produit n’a suggéré une défaillance dans l’extraction. Bien que ce protocole soit conçu pour les embryons d’anémone marine, il sera certainement possible d’appliquer cette méthode à d’autres cnidaires, tels que les coraux et les méduses, où l’information génomique et les embryons sont accessibles. Après cette procédure, les mutants identifiés sont utilisés pour évaluer le phénotype développemental.
Par exemple, des techniques histologiques telles que l’immunostaining peuvent être employées pour évaluer des défauts dans la morphologie, alors que l’hybridation in situ, le RT-PCR quantitatif en temps réel, et le RNA-seq peuvent être utilisés pour évaluer des défauts dans l’expression de gène. En outre, l’imagerie vivante peut être utilisée pour évaluer les défauts de comportement pendant le développement post-embryonnaire, comme chez les larves ou dans les polypes précoces.
