Ainsi, l’analyse du génome de méthylation de l’ADN avec la plate-forme de Los Angeles pour l’aberration complexe de la méthylation de l’ADN dans le génome humain peut fournir des informations importantes sur les biomarqueurs épigénétiques dans le cancer gastro-intestinal. Bien que cette plate-forme de Los Angeles pour l’aberration complexe de la méthylation de l’ADN dans le génome humain, il est optimal en termes de coût et de couverture génomique. Hirotaka Momose, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera donc la procédure.
Pour commencer, préparez 10 micromètres de sections intégrées à la paraffine non tachée de formaline fixe. Placez les glissières dans un support de glissière en verre et remplissez-les de solution saline, en vous assurant que tous les tissus de la glissière sont submergés. Laissez les glissières en xylène pendant 15 minutes, puis versez le xylène tout en tenant les glissières avec une pointe de pipette afin qu’elles ne tombent pas.
Verser plus de xylène au même niveau qu’avant et répéter l’incubation. Versez le xylène et remplissez le support de la glissière avec 100% d’éthanol, en s’assurant que tout le tissu sur la lame est complètement submergé. Laissez les diapositives dans l’éthanol pendant trois minutes, puis remplacez l’éthanol par de l’éthanol frais et laissez-les incuber pendant deux minutes de plus.
Verser l’éthanol et retirer les glissières. Placez-les délicatement face contre terre sur une serviette en papier propre et laissez-les sécher pendant 10 minutes. Remplissez un tube de polypropylène à usage unique de 1,5 millilitre avec 80 microlitres de tampon de lyse et mettez une pointe de pipette propre dans le tampon.
Identifiez les tissus cancéreux de la zone tumorale les plus appropriés pour la macrodissection selon la section tachée appropriée de H&E, puis macrodissect le tissu de cancer basé sur la section marquée. Prenez une lame de rasoir propre et grattez doucement le tissu cancéreux de la lame en essayant de le garder en un seul morceau. Utilisez la pointe pipette pour transférer le tissu gratté dans le flacon tampon de lyse.
Répétez ce processus avec le reste des diapositives. Après tout le tissu est dans le tube, utilisez la pointe pour s’assurer que le tissu a été complètement submergé et n’est pas collé à la paroi. Ajouter 20 microlitres d’une protéase de sérine liée à la subtilisine au flacon et feuilleter doucement pour mélanger.
Placez le flacon dans un bloc thermique de 55 degrés Celsius pendant au moins quatre heures ou toute la nuit, en vous assurant de vortex légèrement après deux heures. Effectuer le traitement à la bisulfite sur 45 microlitres du tissu digéré à l’aide d’un kit de conversion de bisulfite selon les instructions du fabricant. Ajouter cinq microlitres de tampon de dilution à l’échantillon et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Pendant ce temps, préparer le réapprovisionnement de conversion de bisulfite en ajoutant 750 microlitres d’eau distillée et 210 microlitres de tampon de dilution à un tube de réapprovisionnement de conversion CT. Mélanger les tubes en vortexant pendant 10 minutes, puis ajouter 100 microlitres du réaccageur de conversion CT préparé à chaque échantillon et mélanger par inversion. Incuber les échantillons dans l’obscurité à 50 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures.
Après l’incubation, placer les échantillons sur la glace pendant 10 minutes. Ajouter 400 microlitres de tampon de liaison et mélanger chaque échantillon en pipetting de haut en bas. Chargez chaque échantillon dans une colonne de spin et placez la colonne dans un tube de collecte de deux millilitres.
Centrifuger les échantillons à pleine vitesse pendant une minute et jeter le flux à travers. Ajouter 200 microlitres de tampon de lavage à chaque colonne et tourner à pleine vitesse pendant une minute, puis jeter le flux à travers. Ajouter 200 microlitres de tampon de desulphonation à chaque colonne et permettre aux colonnes de se tenir à température ambiante pendant 15 minutes.
Après l’incubation, faire tourner les colonnes à pleine vitesse pendant une minute et jeter le flux à travers. Lavez la colonne deux fois avec 200 microlitres de centrifugeuse tampon de lavage pendant une minute à pleine vitesse après chaque lavage. Ajouter 46 microlitres d’eau distillée à chaque colonne et la placer dans un nouveau tube stérile de polypropylène à usage unique de 1,5 millilitre.
Faites tourner les tubes pendant deux minutes pour élucider l’ADN et jeter la colonne. L’ADN est maintenant prêt pour l’analyse. Utilisez l’ADN modifié bisulfite comme modèle pour pcr quantitatif spécifique à la méthylation pour évaluer la méthylation de la région promoteur dans chaque analyse génétique.
Combinez les reagents tels que décrits dans le manuscrit du texte et utilisez un instrument PCR en temps réel de 96 puits pour exécuter le protocole thermocyclique. Les caractéristiques de 48 patients atteints d’un cancer gastrique dans la cohorte de formation sont montrées ici. L’âge médian des patients était de 74 ans et la cohorte comprenait 38 hommes et 10 femmes.
Premièrement, les 48 échantillons ont été chargés pour identification des valeurs aberrantes. Deux échantillons ont donné des pics supérieurs à deux écarts types déplacés par rapport aux autres et ces échantillons ont été prélevés. La carte thermique qui en a résulte a été divisée en deux groupes basés sur une méthylation élevée et faible.
Cette carte thermique permet la visualisation des 50 meilleures sondes dans les 1500 paires de base du site de démarrage transcriptionnel dans l’analyse différentielle de méthylation. Le type de cancer et la présence de métastase des ganglions lymphatiques sont apparus comme des facteurs prédictifs indépendants significatifs lorsque les facteurs pathologiques cliniques ont été utilisés comme covariates dans l’analyse multivariate. Enfin, le gène EPB41L3 s’est révélé fortement associé à la codification de la cohorte de formation en groupes de méthylation élevés et faibles dans l’analyse du microrése.
Les résultats de l’analyse de microréseau pour EPB41L3 dans la cohorte d’essai ont été validés avec pcr méthylation-spécifique quantitatif. RmVs d’EPB41L3 dans les tissus de PGC étaient sensiblement plus élevés que ceux dans le cancer gastrique de reste dans l’analyse univariate. De même, les RMVs dans les échantillons avec la métastase de ganglion lymphatique étaient sensiblement plus élevés que ceux sans métastase de ganglion lymphatique.
Ainsi, l’identification sur le tissu cancéreux le plus approprié pour la macrodissection selon la section appropriée h & E tachée est nécessaire pour effectuer avec succès ce protocole.
