1(tonalités électroniques)L’optogénétique bioluminescente est une technologie de plate-forme dans laquelle des sources lumineuses génétiquement codées peuvent visualiser et contrôler les fonctions et les réseaux biologiques à l’intérieur et entre les cellules. La bioluminescence atteint tous les domaines de détection de la lumière exprimés dans la population cellulaire cible sans aucun dommage tissulaire et cellulaire par la fibre optique et une exposition physique prolongée à la lumière. Pour commencer, commencez à préparer le bouillon de luciférine en dissolvant cinq milligrammes de CTZ lyophilisé dans 250 microlitres de solvant respectif.
Assurer la dissolution du CTZ le long des parois par pipetage. Tout en protégeant le flacon de la lumière directe, préparez 50 aliquotes de microlitres dans des tubes de microcentrifugation noirs de 0,5 millilitre et stockez les aliquotes à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future. Effectuez toutes les autres manipulations dans une pièce étanche à la lumière dans une hotte à flux laminaire éclairée par une lumière rouge.
Pour effectuer une stimulation lumineuse à bioluminescence unique, préparez une solution de travail de luciférine dans un milieu de culture cellulaire, peu de temps avant de l’ajouter aux cellules à une concentration finale de 100 micromolaires. Ajouter un milieu contenant de la luciférine aux cellules et incuber pendant la durée souhaitée de la stimulation lumineuse. Éteignez le voyant rouge.
Après avoir attendu quelques secondes jusqu’à ce que les yeux se soient ajustés à l’obscurité complète, surveillez l’émission de lumière à l’œil. Documentez l’émission de lumière en prenant une photo. Terminez la stimulation lumineuse en remplaçant le milieu contenant de la luciférine par le milieu de culture, puis lavez les cellules avec le milieu de culture une ou deux fois pour éliminer toute la luciférine en fonction de la sensibilité de l’expérience.
Pour éviter la perte de cellules, plaquez les cellules sur des plats enrobés de PDL et incubez les cellules. Pour effectuer une stimulation lumineuse répétée par bioluminescence, configurez la chambre d’imagerie des cellules vivantes en créant un compartiment étanche à la lumière autour du microscope d’imagerie à cellules vivantes à l’aide d’une boîte et de feuilles noires. Assurez-vous de couvrir toutes les sources lumineuses présentes à l’intérieur de la pièce.
Installez le système de perfusion avec la solution souhaitée pour l’admission et la sortie de la chambre menant à un conteneur à déchets. En fonction du nombre de stimulations répétées, aliquotez la solution d’imagerie de luciférine de travail préparée dans les tubes de microcentrifugation. Placez un couvercle avec des cellules transfectées dans la chambre.
Tout en maintenant la pompe en marche, retirez le tube d’admission de la pompe du bécher d’admission. Immergez rapidement le tube d’entrée dans une solution de luciférine, en gardant le temps de transition court pour éviter tout vide d’air dans le tube. Dès que la solution de luciférine a été absorbée, replacez le tube d’entrée dans le bécher d’admission.
Répétez le retrait et l’immersion du tube d’entrée dans Luciferin autant de fois que nécessaire à des intervalles de plusieurs minutes à quelques heures en fonction du schéma physiologique auquel les cellules sont censées être exposées. Ensuite, conservez les cellules dans un environnement protégé de la lumière pendant 16 à 24 heures pour la transcription ou la durée jusqu’à ce que l’effet de la stimulation lumineuse soit évalué. Pour effectuer l’activation de la bioluminescence in vivo, préparez la luciférine en sortant un flacon de CTZ à moins 80 degrés Celsius, puis laissez-le chauffer à température ambiante dans la zone protégée de la lumière.
Pour chaque flacon contenant 500 microgrammes de CTZ, ajoutez 250 microlitres d’eau stérile à l’aide d’une pipette et remettez le bouchon en caoutchouc sur le flacon. Incuber le flacon en verre reconstitué dans un bain-marie trempé à 55 degrés Celsius pendant quelques minutes pour dissoudre complètement la poudre. Transférer la solution dans un tube de microcentrifugation noir et rincer les parois pour récupérer tout le CTZ.
Après avoir retiré la quantité de solution nécessaire, conservez la solution restante à quatre degrés Celsius. Après avoir préparé, reconstitué et aliquote le véhicule de la même manière, préformer la stimulation lumineuse par bioluminescence en supprimant le volume de luciférine ou de véhicule nécessaire à la taille de l’animal et à la voie d’application choisie. Injectez à l’animal de la luciférine ou un véhicule tel que conçu.
Pour l’activation souhaitée de la recombinase au cours d’un paradigme comportemental spécifique, injectez l’animal juste avant le test comportemental. Pour la transcription phasique, injectez l’animal à plusieurs reprises pendant des jours et collectez les données de l’animal stimulé par la bioluminescence comme prévu. Le système d’expression rapide régulé par la lumière et l’activité a permis la transcription du gène rapporteur avec une augmentation des ions calcium intracellulaires et de la lumière.
La LED bleue a conduit à une fluorescence de rapporteur robuste et l’expression FLuc a été déterminée par des mesures de luminescence après l’ajout de Luciferin. Dans un système d’imagerie in vivo, les LED et les CTZ ont fortement augmenté l’expression de FLuc, tandis que la présence de la composante du facteur de transcription à elle seule a entraîné un signal de fond considérable, peut-être dû à une protéolyse spontanée. NanoLuc a été utilisé pour la régulation optogénique par la dimérisation CRY/CIB et le facteur de transcription photosensible EL222.
La bioluminescence induite par l’ajout de hCTZ aux cellules HEK-293 et son élimination après 15 minutes a été plus efficace que 20 minutes d’exposition aux LED pour CRY/CIB et EL222. Aucune différence significative dans l’efficacité de la transcription n’a été observée entre les deux systèmes lorsqu’ils étaient co-transfectés avec hCTZ, bien que les protéines de fusion de CRY / CIB aient été plus efficaces que EL222. Cry/CIB a montré des niveaux de fond constamment plus élevés par rapport à EL222 indépendamment de la concentration de hCTZ.
La bioluminescence d’une cre recombinase fractionnée photosensible à base de la protéine VVD LOV iCreV a été testée. Les résultats de l’application CTZ ont révélé que la présence de CTZ augmentait considérablement l’expression sur l’arrière-plan et était similaire à l’application LED. L’utilisation de la bioluminescence pour activer non seulement les photorécepteurs en mouvement du fer, mais aussi tous les domaines photosensoriels ajoute une autre dimension à la stimulation lumineuse en élargissant la manipulation des fonctions cellulaires à travers les échelles temporelles et spatiales.
L’optogénétique bioluminescente a été appliquée dans des cellules et des organismes modèles. Ces protocoles peuvent être personnalisés pour tester un large éventail d’hypothèses dirigées in vitro et in vivo.
