Ce protocole est unique car il permet à l’utilisateur d’étudier, d’examiner et de mesurer l’interaction entre les molécules solubles et les surfaces cristallines. Preuves solides de la liaison irréversible des protéines antigel à la glace ou obtenues à l’aide de cette méthode. Le principal avantage de cette technique est la capacité de contrôler la croissance de la glace de taille micronique et d’hydrater les cristaux et d’échanger la solution autour d’eux de manière contrôlée.
Pour commencer, placez le moule pré-préparé dans une boîte de Petri en verre recouverte de papier d’aluminium. Préparez ensuite 30 à 40 millilitres du mélange PDMS en pesant un mélange de 1 à 10 de l’agent de durcissement et de l’élastomère et en mélangeant en continu pendant environ cinq minutes jusqu’à ce que le mélange apparaisse blanc et presque opaque. Ensuite, versez le mélange PDMS dans la boîte de Petri avec le moule et dégazez dans un dessiccateur jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles.
Cuire le moule avec le PDMS liquide dans un four ou sur une plaque chauffante à 70 degrés Celsius jusqu’à obtenir une consistance caoutchouteuse. Ensuite, découpez l’appareil en traçant autour des traits avec un scalpel, en prenant soin de pousser vers l’avant avec le scalpel au lieu de le baisser, car le moule est fragile. Après avoir retiré le dispositif PDMS découpé, placez-le à l’envers dans une nouvelle boîte de Pétri.
À l’aide d’une seringue émoussée, d’une aiguille de calibre 20, percez des trous dans l’appareil en fonction du motif imprimé. Insérez ensuite le PDMS nettoyé et le couvercle dans le nettoyeur plasma. Fermez les vannes et allumez l’alimentation, le vide et la pompe.
Laissez le nettoyeur de plasma fonctionner pendant environ une minute. Réglez la RF à haute température et laissez entrer un peu d’air dans le nettoyeur plasma à l’aide de la valve fine. Lorsque la couleur des fenêtres d’affichage passe du violet au rose, laissez le nettoyeur plasma agir pendant 50 secondes pour désactiver la RF.
Maintenez la pompe allumée pendant une minute et, après l’avoir éteinte, ouvrez progressivement la vanne principale pour permettre à l’air d’entrer dans le nettoyeur plasma. Appuyez ensuite sur la surface PDMS sur le couvercle nettoyé et confirmez qu’ils sont collés en n’observant aucun détachement lorsque vous tirez légèrement vers le haut sur le bordereau. Après avoir fixé l’aiguille d’une aiguille émoussée à 90 degrés avec une paire de pinces, insérez une extrémité de l’aiguille dans un tube Tygon et l’autre extrémité dans l’un des trous perforés de l’appareil tout en répétant le processus pour les autres trous.
Appliquez une petite quantité d’huile d’immersion sur la surface de l’étage froid en cuivre et étalez-le à l’aide d’une lingette non pelucheuse pour créer une fine couche d’huile. Ensuite, placez un disque de saphir propre sur la couche d’huile créée. Appliquez ensuite une gouttelette d’huile d’immersion sur le centre du disque saphir et positionnez le dispositif PDMS sur la goutte de manière à ce que les caractéristiques de l’appareil soient alignées sur le trou de visualisation de l’étage froid.
Après avoir maintenu l’appareil en place, fixez le tube aux parois extérieures de la boîte en aluminium qui abrite le ruban adhésif. À l’aide d’une seringue en verre, injecter quatre à cinq microlitres de solution protéique antigel dans le canal d’entrée et fermer le couvercle de l’étage froid. Lancez le programme de contrôle de la température et réglez la température à moins 25 degrés Celsius.
Ensuite, augmentez lentement la température d’environ un degré Celsius toutes les cinq secondes. Approchez du point de fusion des échantillons, qui peut varier de moins 1 à moins 0,2 degré Celsius, selon le tampon utilisé dans la solution protéique antigel. Pour mieux observer les monocristaux, passez à des objectifs 10x ou 20x.
Et après avoir obtenu un seul cristal à l’endroit souhaité, cultivez le cristal en diminuant légèrement la température jusqu’à ce que les extrémités du cristal rencontrent les parois du canal. Après être passé à l’objectif 50x, injecter la solution protéique antigel dans les canaux et observer l’augmentation de l’intensité de fluorescence, indiquant que la solution protéique a été injectée avec succès dans les canaux. Pour enregistrer le processus d’échange de solution, utilisez le programme d’imagerie NIS-Elements, en veillant à ce que la pression appliquée ne soit pas trop élevée et injectez lentement la solution tampon dans la deuxième entrée du dispositif microfluidique.
Observez une diminution du signal fluorescent à un taux qui dépend de la pression appliquée à la seringue. Pour obtenir des hydrates de THF après avoir préparé une solution d’eau de THF avec un rapport molaire de 1 à 15, injecter la solution dans le dispositif microfluidique. Une fois la solution d’eau THF congelée, augmentez lentement la température jusqu’à ce que toute la glace ait fondu à l’exclusion des hydrates et maintenez la température à un degré Celsius pendant trois minutes.
Réglez la température à moins deux degrés Celsius et observez l’abondance des hydrates qui apparaissent dans les canaux microfluidiques en l’absence d’inhibiteurs. Injectez ensuite la protéine ou l’inhibiteur antigel dans le canal microfluidique à l’aide de la seringue en verre tout en ajustant la température pour s’assurer que les cristaux obtenus ne fondent pas ou ne se développent pas et laisser quelques minutes aux molécules inhibitrices pour s’adsorber à la surface du cristal. Effectuer l’échange de solution en injectant la solution sans inhibiteur dans le canal.
Prenez des images du cristal avant et après l’échange de solution et analysez l’intensité de fluorescence sur le cristal et dans la solution à l’aide du programme d’imagerie. Un échange de solution réussi autour d’un cristal de glace a été effectué, indiquant que l’échange de solution était relativement rapide. Cependant, un échange plus lent est possible.
L’intensité de fluorescence provenant des molécules de glycoprotéines antigel adsorbées par la glace a été clairement observée après la fin de l’échange. Une analyse quantitative de la concentration de protéines antigel a été surveillée et l’intensité de fluorescence a été déterminée dans la solution et sur la glace, indiquant que le signal de fluorescence dans la solution est diminué d’un facteur 100 pendant l’échange de solution, tandis que le signal calculé à la surface de la glace reste constant. Des expériences microfluidiques avec des hydrates de THF ont été réalisées où une solution sans inhibiteur a été injectée dans les canaux après que les cristaux d’hydrate aient été autorisés à adsorber les molécules inhibitrices.
Les hydrates de THF ont été observés après échange de solution avec deux types d’inhibiteurs, y compris les glycoprotéines antigel marquées avec de l’isothiocyanate de fluorescéine et la safranine O, un colorant fluorescent. Les étapes critiques de cette procédure sont la formation et l’isolement d’un seul cristal dans les canaux microfluidiques et l’échange de solution autour de celui-ci. Cette méthode peut être utilisée avec d’autres matériaux cristallins très sensibles à la température, dans le but de comprendre le mécanisme par lequel les inhibiteurs interagissent avec ces cristaux.
La possibilité d’échanger des solutions autour de cristaux a ouvert la voie aux chercheurs pour identifier des informations clés sur le mécanisme de liaison des protéines antigel et pour découvrir un nouveau phénomène d’effet isotopique sur la croissance de la glace.
