Cette méthode permettra de caractériser différentes cellules immunitaires dans les mêmes états de maladie des personnes atteintes de MI, ce qui élargira notre compréhension du mécanisme de l’infection par le VEB. La démonstration de la procédure sera Linlin Zhang, un médecin de notre laboratoire. Pour commencer, prenez les PBMC isolés précédemment dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et faites-les tourner à 300 G pendant 10 minutes à température ambiante.
Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 80 microlitres du tampon préparé. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de microbilles CD 14 à la suspension cellulaire, bien mélangée par pipetage, et incuber le tube pendant 15 minutes sur de la glace. Ensuite, lavez les PBMC à l’aide d’un millilitre de tampon et centrifugez à 300 G pendant 10 minutes à température ambiante.
Jetez tout le surnageant et remettez les cellules en suspension avec 500 microlitres de tampon. Pour la séparation magnétique, placez une colonne sur le séparateur de billes magnétiques et amorcez la colonne en la lavant avec trois millilitres de tampon. Ensuite, ajoutez la suspension de cellule à la colonne.
Laissez-le passer et collectez les cellules non marquées dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon et recueillez l’ensemble de l’effluent dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Maintenant, placez la colonne dans un nouveau tube à centrifuger de 15 millilitres et ajoutez cinq millilitres de tampon à la colonne.
Poussez fermement le piston dans la colonne pour rincer les cellules marquées magnétiquement dans le tube. Centrifuger les cellules marquées magnétiquement à 300 G pendant cinq minutes. Après avoir retiré le surnageant, re-suspendre les cellules dans 500 microlitres de PBS et transférer la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre pour le séquençage ultérieur du transcriptome.
les cellules non marquées collectées en les centrifugeant à 300 G pendant cinq minutes et remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de PBS dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez deux microlitres de chaque anticorps marqué à la suspension cellulaire et incuber sur de la glace pendant 30 minutes, à l’abri de la lumière. Ensuite, aliquote 100 microlitres de la suspension cellulaire PBMC dans des tubes microcentrifugés de 1,5 millilitre pour mettre en place un échantillon témoin négatif CD 3, CD 4, CD 8 et CD 19, des échantillons de coloration simples et un échantillon de coloration CD 56 ou CD 16.
Ajoutez ensuite deux microlitres de l’anticorps marqué par fluorescence correspondant à chaque tube et incuber sur de la glace pendant 30 minutes, à l’abri de la lumière. Après l’incubation, laver toutes les cellules avec du PBS comme démontré précédemment, et remettre en suspension dans 500 microlitres de PBS. Ouvrez le système de tri des cellules et exécutez le programme de mise sous tension.
Ensuite, installez la buse de 85 micromètres et ouvrez le flux de tri. Réglez la tension de tri sur 4 500 volts et la fréquence sur 47. Réglez l’écart à 8 dans la fenêtre de rupture et activez le mode de tri automatique sweet spot pour déterminer automatiquement la valeur d’amplitude des gouttelettes.
Enfin, réglez le délai de gouttelettes à 30,31 dans la fenêtre de flux latéral. À l’aide d’un diagramme de points à dispersion avant ou latérale, dessinez la porte polygonale P1 pour identifier la population de lymphocytes intacte. Ensuite, à l’aide d’un diagramme de points de la zone de dispersion vers l’avant en fonction de la hauteur, dessinez la porte polygonale P2 pour identifier les cellules individuelles et exclure les doublets.
Ensuite, en utilisant une aire FITC CD 19 par rapport à CD 3 par diagramme de points de surface CPCY 5.5, dessinez la porte rectangulaire P3 pour sélectionner les cellules T positives CD 3 et les cellules B positives CD 19. Ensuite, à l’aide d’un diagramme de points de zone CD 4 APCCY 7 par rapport à un diagramme de points de zone PE CD 8, tracez une porte rectangulaire pour sélectionner les cellules T positives CD 4 et CD 8. Enfin, à l’aide d’un diagramme de points de zone de diffusion latérale par rapport au diagramme de points APC de zone DC 56 ou CD 16, tracez une porte rectangulaire pour sélectionner les cellules tueuses naturelles positives CD 56 ou CD 16.
Pour le tube de contrôle négatif, cliquez sur charger dans le tableau de bord d’acquisition et sélectionnez les paramètres du cytomètre dans le logiciel. Dans la fenêtre de l’inspecteur, cliquez sur l’onglet Paramètres et réglez les tensions de diffusion directe, de diffusion latérale et de différents colorants fluorescents. Après avoir chargé les tubes colorés simples dans le cytomètre, cliquez sur charger dans le tableau de bord d’acquisition, puis cliquez sur l’onglet de compensation pour ajuster la compensation, comme décrit dans le texte.
Vortex doucement la suspension cellulaire, avant de charger le tube dans le cytomètre. Ajouter 200 microlitres de FBS à quatre tubes d’écoulement de collecte et vorter les tubes. Placez-les dans la chambre de collecte du cytomètre.
Rassemblez les différents types de cellules séparément dans les quatre tubes d’écoulement. Faites tourner les cellules séparées à 300 G pendant cinq minutes et ajoutez 200 microlitres de réactif d’isolement d’ARN à la palette cellulaire pour le séquençage du transcriptome. Dans la présente étude, les sous-populations de cellules immunitaires du sang périphérique de différents échantillons ont été triées efficacement en combinant les techniques des billes immunomagnétiques et du tri cellulaire activé par fluorescence.
Fait important dans ce protocole, l’étape de tri cellulaire a été optimisée pour améliorer la viabilité cellulaire. Les cellules immunitaires triées ont montré une proportion accrue de cellules T positives CD3, CD 8 chez les patients atteints de mononucléose infectieuse par rapport aux porteurs sains du virus d’Epstein-Barr et aux échantillons non infectés. En revanche, une diminution des proportions de cellules T CD3, CD 4 positives et CD 19 positives B a été observée chez les patients atteints de mononucléose infectieuse par rapport aux porteurs sains du VEB et aux enfants non infectés par le VEB.
De plus, une diminution des proportions de cellules tueuses naturelles positives au CD 56 ou au CD 16 a été observée chez les patients atteints de mononucléose infectieuse par rapport aux enfants non infectés par le VEB. Le maintien de la viabilité cellulaire est vital pour les expériences ultérieures. Garder les cellules sur la glace ou dans le réfrigérateur pendant le processus de tri est bénéfique pour la viabilité des cellules.
