Ce travail a été soutenu par la Leading Initiative for Excellent Young Researchers (du MEXT) ; une subvention pour la recherche scientifique (B) (numéro de subvention JP21H02352) ; Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED-RPIME, numéro de subvention JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901) ; la Fondation commémorative d’Uehara ; Fondation Astellas pour la recherche sur les troubles métaboliques ; Fondation commémorative Suzuken, Fondation des sciences de la vie Akiyama et Fondation de recherche en neurosciences de Narishige. Nous remercions également Nur Farehan Asgar, Ph.D, pour avoir édité une ébauche de ce manuscrit.

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Kumamoto.
REMARQUE : Pour soulager la douleur, l’ibuprofène a été administré dans l’eau potable (0,11 mg/mL) pendant 48 h, et la buprénorphine (0,05-0,1 mg/kg i.p.) a été administrée 30 min avant la chirurgie. Les conditions stériles comprennent les gants, les masques et les instruments autoclavés stérilisés à l’oxyde d’éthylène entre les animaux. L’opération a été réalisée sur un coussin chauffant réglé à 37 °C et recouvert d’un nouveau tapis de laboratoire pour chaque animal. Avant l’opération, la zone chirurgicale a été nettoyée avec une solution de bétadine et de l’alcool. Tous les instruments chirurgicaux ont été stérilisés à l’autoclave (pour un maximum de deux chirurgies). Avant de faire l’incision, les souris ont été vérifiées pour s’assurer qu’elles étaient complètement anesthésiées. La profondeur de l’anesthésie pour chaque souris a été évaluée avant et pendant la chirurgie par pincement des orteils. La période d’acclimatation ne dépassait pas 5 minutes à chaque fois. Suivez les instructions de l’IACUC de l’institution concernée.
1. Préparation des tubes pour la veine jugulaire et l’artère carotide
<ol><li>Stérilisez tous les tubes, les fournitures en polypropylène (p. ex., les pointes de pipette) et les sutures avec un autoclave ou de l’oxyde d’éthylène. Pour la veine jugulaire, raccorder 8 cm de tube1 (voir Matériaux) et 3 cm de tube2 à l’aide de colle (figure 2A). Mettez 2 mm de tubulure 1 sur le dessus car la tubulure 2 (polyéthylène) est trop dure et peut endommager les vaisseaux sanguins (tubulure 1.1).</li>
	<li>Sonde d’extension pour la veine jugulaire (Tubulure 1.2) pour perfuser du glucose et de l’insuline<ol><li>Préparez deux tubes de 30 cm et un tube de 10 cm avec un tube2 (Figure 2A). Coupez l’extrémité pointue d’une pointe de pipette de 20 μL (ou tout ce qui a une extrémité étroite avec un diamètre extérieur < 0,5 mm pour se connecter à la tubulure 1,1) et placez-y trois tubulures2 (30 cm, 30 cm et 10 cm) ensemble. Sceller avec de la colle adhésive.</li>
		<li>Placez 5 cm de tube1 à l’autre extrémité du tube2.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour l’artère carotide (Tubulure 1.3) : Étirez la tubulure 2 pour la rendre plus fine. Connectez 8 cm de tube1 et 3 cm de tube étiré2 à l’aide de colle (Figure 2A). Faites une marque à 9 mm de la pointe.</li>
	<li>Aiguille à extrémité non tranchante qui relie le tube à la seringue : Faites une égratignure près de l’extrémité pointue de l’aiguille (23 G) avec une lime métallique, pliez-la doucement d’avant en arrière plusieurs fois avec une pince et cassez-la. Faites la même coupe au milieu de l’aiguille pour faire un morceau de connecteur métallique (Figure 2A).</li>
	<li>Tube d’extension pour l’artère pour prélever du sang (Ensemble de tubulures 1.4) : Connectez 10 cm de tube1 avec le connecteur métallique et l’aiguille non tranchante qui a été fabriquée à l’étape 1.4. REMARQUE : Tous les tubes et sutures sont stérilisés avec un autoclave ou de l’oxyde d’éthylène</li>
</ol>2. Chirurgie
<ol><li>Anesthésier une souris avec de l’isoflurane (1,5-2,0 %) ou de la kétamine/xylazine (kétamine 10 mg/mL, xylazine 1 mg/mL dans une solution saline stérile à 0,9 %, 0,1 mL/10 g de poids corporel (PC) par injection intrapéritonéale [ip]). Gardez la souris sur le tapis chaud (37 °C) pour réduire le stress physique. Attendez une anesthésie profonde pendant 5 à 10 minutes. Confirmez la profondeur de l’anesthésie par le réflexe de la pédale, la respiration et la fréquence cardiaque, et la réponse aux stimuli par pincement des orteils. Pendant la chirurgie, du ruban chirurgical doit être utilisé pour fixer le capuchon nasal à la table d’opération pour une inhalation continue de l’anesthésie. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.</li>
	<li>Remplir une solution saline héparinée (100 U/mL) dans les tubes 1.1 et 1.3 et les raccorder avec une seringue de 1 mL avec une aiguille non tranchante (figure 2B). Fermez l’extrémité du tube3 (voir Tableau des matériaux) en le faisant fondre avec un fer à souder, qui servira de capuchons pour les tubes1.1 et les tubes1.3.</li>
	<li>Rasez et essuyez la première (interscapulaire sur le dos) et la deuxième (cou à l’avant) zone d’incision avec trois cycles de bétadine à 10 % suivis d’une préparation préopératoire avec de l’alcool stérile à 70 %. Faites une petite incision verticale de 5 mm céphalique sur la ligne médiane du sternum, disséquez les tissus et exposez l’artère. Séparez le nerf vague de l’artère. Cela réduit les effets négatifs de l’ablation du nerf vague sur le métabolisme du glucose. REMARQUE : L’étape de l’incision ventrale à l’étape où le cathéter est inséré dans la veine et fixé avec des sutures en soie est réalisée au microscope.</li>
	<li>Placez deux sutures en soie sous l’artère. Arrêtez le flux sanguin en attachant fermement une suture du côté crânien (Figure 2C-1) et l’autre lâchement du côté caudal (Figure 2C-2), ce qui est suffisant pour arrêter le flux sanguin mais suffisant pour s’ouvrir à nouveau plus tard. Placez une autre suture sous l’artère (Figure 2C-3).</li>
	<li>Coupez l’artère près de la figure 2C-1 avec des ciseaux à ressort et placez le tube 1.3 dans l’artère. Faites une attache lâche sur l’artère et la tubulure (Figure 2C-3, ne l’attachez pas fermement. Le tube sera inséré plus profondément dans l’artère). Ouvrez le nœud du côté caudal (figure 2C-2) pour insérer le tube jusqu’à ce que la marque de 9 mm atteigne le nœud du milieu (figure 2C-3). Attachez solidement toutes les ligatures et rincez avec une solution saline stérile héparinisée.</li>
	<li>Exposez la veine jugulaire droite à partir de la même incision que l’artère carotide droite pour le cathéter jugulaire. Isolez l’extrémité crânienne et ligaturez-la avec une suture en soie (Figure 2D-1, Tableau des matières). Placez un autre morceau de suture à l’extrémité caudale de la veine exposée (figure 2D-2). Coupez la veine près de la marque Figure 2D-1 avec des ciseaux à ressort.</li>
	<li>Insérez le cathéter (pas trop profondément pour éviter de pénétrer dans les vaisseaux), attachez-le et confirmez visuellement qu’il prélève du sang. Rincer avec une solution saline stérile héparinée (0,2 ml) et confirmer visuellement qu’il ne reste pas de sang dans le cathéter.</li>
	<li>Placez la souris sur le nouveau champ chirurgical stérile pour éviter l’infection de la première plaie. Retournez la souris, essuyez avec trois cycles de bétadine suivis d’une préparation préopératoire avec de l’alcool stérile et faites une petite incision entre les omoplates.</li>
	<li>Passez un porte-aiguille sous la peau de l’incision à l’arrière vers la face ventrale. Clampez les cathéters avec le porte-aiguille, passez-les sous la peau et ramenez-les. Nettoyez le site d’incision et fermez les incisions ventrales avec une suture synthétique (diamètre 0,15-0,2 mm). Clamper le cathéter veineux avec une micro serrefine au site d’incision entre les omoplates.</li>
	<li>Coupez le cathéter à 1 cm au-dessus de la pince, rincez-le avec une solution saline héparinisée et fermez-le avec un capuchon (étape 2.4). Suivez la même procédure pour le cathéter artériel. Fermez l’incision dorsale avec une suture synthétique (diamètre 0,15-0,2 mm).</li>
	<li>Placez la souris dans une cage chaude et propre (Figure 2E). Effectuez des soins postopératoires quotidiennement.</li>
</ol>3. Récupération
<ol><li>Isolez la souris parce qu’une autre souris peut mordre le cathéter dans le logement de groupe.<ol><li>Pour réduire le stress lié à l’isolement social, gardez les souris avec des enrichissements environnementaux (par exemple, des abris). Effectuez des soins postopératoires quotidiennement. Pour soulager la douleur, la détresse et l’inconfort, prodiguez des soins postopératoires, y compris une analgésie (ibuprofène dans l’eau potable (0,11 mg/mL).</li>
		<li>Observez les souris pour détecter des signes d’infection, tels que des pourritures, une léthargie ou une douleur au site d’incision. La plupart des souris en bonne santé commencent à marcher et à se nourrir environ 2 heures après la chirurgie. Une posture voûtée, une fourrure ébouriffée et une diminution de la consommation de nourriture peuvent indiquer une douleur. Si ces signes sont observés, euthanasier immédiatement les souris en les décapitant sous anesthésie profonde ou asphyxie au dioxyde de carbone.</li>
	</ol></li>
	<li>Le sang pénètre dans le cathéter de l’artère et forme un caillot. Pour maintenir les lignes du cathéter, retirez le caillot quotidiennement, en suivant les étapes 3 à 6.</li>
	<li>Remplir une seringue de 1 mL et une aiguille de 23 G (extrémité non pointue) avec une solution saline héparinisée (100 U/mL). À l’aide d’une chambre à induction, anesthésier légèrement la souris avec de l’isoflurane (1,0 % à 1,5 %). Ensuite, retirez la souris de la chambre et effectuez l’élimination du caillot sous anesthésie à l’isoflurane avec un capuchon nasal.</li>
	<li>Clamp le tube de l’artère sur le dos de la souris avec micro serrefine, retirer le capuchon et extraire le sang et les caillots. Rincer le cathéter avec une solution saline héparinisée à l’aide d’une autre seringue de 1 mL avec une aiguille de 23 G (extrémité non pointue) et le reboucher. Nettoyez la ligne veineuse comme la ligne artérielle en cas de coagulation sévère.</li>
	<li>Faites la même procédure pour nettoyer le cathéter une fois par jour pendant 3 à 5 jours.</li>
	<li>Vérifiez le poids corporel de la souris. Si le poids corporel diminue de plus de 10 % par rapport au jour de la chirurgie, appliquez des soins de soutien et essayez d’améliorer le score d’état corporel normal, et utilisez la souris pour une autre expérience. NOTE : La perte de poids des animaux était inférieure à 10 % dans les expériences de cette étude. La perte de poids affectera fortement le métabolisme systémique du glucose. Ainsi, il est recommandé d’attendre la récupération du poids corporel ou de retirer de l’expérience de la pince.</li>
</ol>4. Installez le système de pompe (pour pince hypoglycémique)
<ol><li>Préparez 1 U/mL d’insuline dans une solution saline à 0,1 % de BSA, 30 % de glucose dans une solution saline et une solution saline héparinisée.</li>
	<li>Mesurez le poids corporel de la souris. Calculer le volume d’insuline à 1 U/mL pour faire perfuser l’insuline (10 mU/kg/min). Perfuser 1,7 μL/min de solution d’insuline dans les souris de l’expérience clamp. Pour faire 300 μL de perfusion d’insuline, le volume requis pour 1 U/mL d’insuline (μL) est de 2,647 (μL/g) x poids corporel (g). Un volume de 300 μL de perfusion d’insuline suffit pour terminer l’expérience de pince sur 1 souris. Le tableau 1 montre un exemple de perfusion d’insuline.</li>
	<li>Remplissez la perfusion d’insuline et le glucose à 30 % dans chaque seringue Hamilton, connectez-les avec la tubulure 1.2 et placez la seringue sur le pousse-seringue (Figure 3A). Remplir chaque solution dans un tube 1.2. Remplir une solution saline dans un ensemble seringue et tubulure de 1 mL 1.4 (figure 2A).</li>
	<li>Anesthésier la souris avec de l’isoflurane (1,0 % à 1,5 %) et connecter la tubulure1.2 au cathéter veineux et l’ensemble de tubulures1.4 au cathéter artériel (Figure 3A). Utilisez du ruban de cellophane pour maintenir les tubes ensemble.</li>
	<li>Placez la souris dans un bécher vide de 500 ml. REMARQUE : Pour une pince hyperglycémique, utilisez une solution saline au lieu de 1 U/mL d’insuline.</li>
</ol>5. Pince hypoglycémique
<ol><li>Mesurez la glycémie toutes les 5 à 10 minutes, comme le montre la figure 3B, et prélevez des échantillons de sang pour les mesures hormonales à -15 minutes, 10 minutes, 20 minutes, 40 minutes, 60 minutes, 80 minutes, 100 minutes et 120 minutes. Suivez l’étape 5.2 pour mesurer la glycémie. REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de mesurer la glycémie à tout moment, mais il est recommandé de la mesurer au moins toutes les 10 minutes. Mesurez la glycémie toutes les 5 minutes lorsque son taux et son débit de perfusion de glucose ne sont pas stables.</li>
	<li>Clamp l’extrémité supérieure du jeu de tubulures1.4 et connectez une nouvelle seringue, extrayez 50 μL de sang et placez-le dans un tube de 1,5 mL pour le lavage. Mesurez la glycémie. REMARQUE : Il s’agit du sang dilué par la solution saline dans le tube en raison du lavage du cathéter après le prélèvement précédent. Un volume de 50 μL suffit pour remplacer le sang dilué par du sang pur.</li>
	<li>Conservez le sang dilué (globules rouges). Lavez le sang accumulé (~500 μL) avec une solution saline (voir les étapes 5.11-5.12) et retournez-le dans le corps pour éviter l’hypoxie.</li>
	<li>Le cathéter est connecté à l’artère avec une pression artérielle élevée, donc lorsque la pince est desserrée, le sang s’écoule et est utilisé pour mesurer le glucose avec un glucomètre pratique. Perfuser 50 μL de solution saline pour conserver une quantité suffisante de liquide sanguin.</li>
	<li>Pour le prélèvement sanguin, prélevez 50 μL de sang supplémentaire et placez-le dans un tube de 1,5 mL sur de la glace. Perfuser 100 μL (50 μL de remplacement + 50 μL d’échantillonnage) de solution saline.</li>
	<li>Après 0 min de mesure de la glycémie, démarrez la pompe à seringue à insuline. Perfuser d’abord 30 mU/kg/min en bolus pendant 2 min (5,1 μL/min), puis 10 mU/kg/min (1,7 μL/min) en perfusion pendant le reste de la durée.</li>
	<li>Mesurez la glycémie et modifiez le débit de perfusion de glucose toutes les 5 à 10 minutes pendant 120 minutes.</li>
	<li>Créez un état d’équilibre où le débit de perfusion de glucose ne change pas et où la glycémie est de 50 mg/dL.</li>
	<li>Après avoir prélevé l’échantillon de sang à t = 120 min, perfuser un agent euthanasique dans la veine jugulaire et prélever des tissus pour analyse de l’ARN ou des protéines.</li>
	<li>Centrifugez le sang à 1000 x g pendant 5 min et mesurez la concentration d’hormones telles que l’insuline ou le peptide c à l’aide d’un kit ELISA selon le protocole du fabricant.</li>
	<li>Pour laver le sang, centrifuger le sang à 1000 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant, ajouter 500 μL de solution saline héparinée et effectuer un pipetage.</li>
	<li>Répétez le lavage et placez les globules rouges lavés dans une seringue de 1 mL pour l’artère. Les cellules sanguines seront réinjectées automatiquement lorsque 50 ou 100 μL de solution saline sont perfusés aux étapes 5.2 et 5.3. Surveillez attentivement l’hématocrite pour prévenir l’hypoxie. REMARQUE : Pour la mesure de la glycémie, un glucomètre pratique commercial a été utilisé.</li>
</ol>6. Pince hyperglycémique
<ol><li>Suivez les étapes de la technique du clamp hypoglycémique, mais sans perfusion d’insuline et avec une glycémie ajustée à 250-300 mg/dL. Mesurez la glycémie toutes les 5 à 10 minutes, comme le montre la figure 3B, et prélevez des échantillons de sang pour les mesures hormonales à -15 minutes, 10 minutes, 20 minutes, 40 minutes, 60 minutes, 80 minutes, 100 minutes et 120 minutes.</li>
	<li>Connectez une nouvelle seringue au jeu de tubulures1.4, extrayez 50 μL de sang et placez-la dans un tube de 1,5 mL pour le lavage.</li>
	<li>Pour le prélèvement sanguin, prélevez 50 μL de sang supplémentaire et placez-le dans un tube de 1,5 mL sur de la glace. Perfuser 100 μL (50 μL de remplacement + 50 μL d’échantillonnage) de solution saline.</li>
	<li>Après 0 min de mesure de la glycémie, démarrez le pousse-seringue à glucose. Perfusez d’abord 30 g/kg/min en bolus pendant 2 min (5,1 μL/min), puis 10 g/kg/min (1,7 μL/min) pendant le reste de la durée.</li>
	<li>Mesurez la glycémie et modifiez le débit de perfusion de glucose toutes les 5 à 10 minutes pendant 120 minutes. Créez un état stable où le débit de perfusion de glucose ne change pas et où la glycémie est de 250 à 300 mg/dL, un état hyperglycémique serré.</li>
</ol>

Installation chirurgicale de pinces hyperglycémiques et hypoglycémiques chez la souris

<ol>
	<li>Seaquist, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoglycemia+and+diabetes:+A+report+of+a+workgroup+of+the+american+diabetes+association+and+the+endocrine+society.">Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).</li><li>Amiel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoglycaemia,+cardiovascular+disease,+and+mortality+in+diabetes:+epidemiology,+pathogenesis,+and+management.">Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management.</a> The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).</li><li>. 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G., Krizsan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islets+of+obese+hyperglycemic+mice+(ob/ob).">Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob).</a> Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).</li><li>Uchida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+TRPM2+impaired+insulin+secretion+and+glucose+metabolisms+in+mice.">Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice.</a> Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).</li><li>Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. A., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+in+vivo+and+ex+vivo+assessments+of+glucose-stimulated+insulin+secretion+in+mouse+islet+&#946;+cells.">Protocol for in vivo and ex vivo assessments of glucose-stimulated insulin secretion in mouse islet &#946; cells.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100728 (2021).</li><li>Moull&#233;, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+control+of+pancreatic+beta+cells:+What+is+known+on+the+regulation+of+insulin+secretion+and+beta-cell+proliferation+in+rodents+and+humans.">Autonomic control of pancreatic beta cells: What is known on the regulation of insulin secretion and beta-cell proliferation in rodents and humans.</a> Peptides. 148, 170709 (2022).</li><li>Honzawa, N., Fujimoto, K., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomous+dysfunction+and+insulin+resistance+in+pancreatic+&#945;+cells.">Cell autonomous dysfunction and insulin resistance in pancreatic &#945; cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3699 (2019).</li><li>Siddiqui, A., Madhu, S. V., Sharma, S. B., Desai, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+stress+responses+and+risk+of+type+2+diabetes+mellitus.">Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus.</a> Stress. 18 (5), 498-506 (2015).</li><li>Chan, O., Sherwin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+VMH+fuel+sensing+on+hypoglycemic+responses.">Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).</li><li>Donovan, C. M., Watts, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+and+central+glucose+sensing+in+hypoglycemic+detection.">Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection.</a> Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).</li><li>TeSlaa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+source+of+glycolytic+intermediates+in+mammalian+tissues.">The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues.</a> Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

La méthode décrite ici est simple et peut être réalisée avec des pointes de pipette, des seringues et d’autres articles trouvés dans les laboratoires ordinaires. Bien que les chercheurs puissent avoir besoin d’acheter des tubes et des pompes supplémentaires, aucun équipement coûteux n’est nécessaire. Ainsi, ce protocole de cathétérisme et de clampage est plus facile à démarrer par rapport aux rapports précédents 12,13,14.<sup clas...

Le glucose est une source d’énergie importante pour les cellules, et un manque de glucose peut entraîner divers symptômes et complications. En cas d’hypoglycémie (hypoglycémie, généralement inférieure à 70 mg/dL de glycémie à jeun, mais ne doit pas être déterminée par une seule valeur1), les symptômes les plus courants sont la faiblesse, la confusion, la transpiration et les maux de tête. Il peut également perturber la fonction cérébrale et augmenter le risque d’événements cardiovasculaires et de mortalité2. À l’inverse, l’hyperglycémie est une condition médicale dans laquelle la concentration plasmatique de glucose dépasse les niveaux normaux (généralement > 126 mg/dL en glycémie à jeun3). Cela peut se produire chez les personnes atteintes de diabète qui présentent un déficit de production ou d’utilisation d’insuline. L’hyperglycémie peut entraîner une acidocétose diabétique, qui se produit lorsque le corps ne peut pas utiliser le glucose comme énergie mais décompose les acides gras comme carburant. L’état hyperosmolaire hyperglycémique augmente également la mortalité4. L’hyperglycémie à long terme peut endommager les vaisseaux sanguins, les nerfs et les organes, entraînant le développement de plusieurs complications chroniques telles que les maladies cardiovasculaires, les rétinopathies et les maladies rénales. Ainsi, la glycémie doit être maintenue dans une fourchette étroite entre 100 mg/dL et 120 mg/dL.
La glycémie est régulée par l’équilibre entre l’entrée et la sortie de glucose dans un modèle à un compartiment (Figure 1A). L’apport en glucose comprend le glucose absorbé par les aliments et la production de glucose par le foie, les reins et l’intestin grêle. La production de glucose comprend l’absorption du glucose dans les tissus et l’élimination du glucose par les reins. La quantité de glucose entrant et sortant est régulée par les hormones endocriniennes. Par exemple, le glucagon, la corticostérone et les catécholamines, connus sous le nom d’hormones contre-régulatrices, sont libérés lorsque la glycémie diminue5. Ils stimulent la dégradation du glycogène et la synthèse du glucose, principalement du foie ; Ces processus sont connus sous le nom de glycogénolyse et de gluconéogenèse, respectivement. L’hyperglycémie augmente la libération d’insuline par les cellules β pancréatiques et stimule l’absorption du glucose dans les muscles, les tissus adipeux et le cœur 6,7,8,9. L’exercice augmente l’absorption de glucose indépendante de l’insuline10. Le système nerveux sympathique augmente l’absorption du glucose dans les muscles et le tissu adipeux brun 6,11. Pour mesurer la capacité à réguler le métabolisme du glucose dans les tissus périphériques, les chercheurs utilisent généralement le test de tolérance au glucose (GTT) et le test de tolérance à l’insuline (ITT) (Figure 1B,C). Dans le GTT, deux facteurs doivent être pris en compte : la libération d’insuline et la sensibilité à l’insuline (Figure 1B). Cependant, la courbe de concentration de glucose pendant le test de 120 minutes est différente chez chaque souris, ce qui peut affecter différentes quantités de libération d’hormones. Dans le cas de l’ITT, la glycémie est régulée à la fois par la sensibilité à l’insuline et la libération d’hormones contre-régulatrices. Par conséquent, il est difficile de déterminer la signification précise du métabolisme du glucose, de la libération d’insuline et de la sensibilité à l’insuline dans les situations où la glycémie n’est pas constante.
Pour surmonter ces problèmes, il est souhaitable de maintenir la glycémie à un niveau constant (ou « clamp »). Dans le clamp hyperglycémique, le glucose est infusé dans la circulation sanguine pour augmenter la glycémie à un niveau spécifique, puis maintenu à ce niveau pendant un certain temps. La quantité de glucose infusé est ajustée en fonction des mesures de la glycémie toutes les 5 à 10 minutes pour maintenir un état d’équilibre. Cette technique est particulièrement utile pour comprendre les paramètres de la sécrétion d’insuline à un taux de glucose clampé. Le clamp hypoglycémique est une méthode pour maintenir une glycémie basse en perfusant de l’insuline. Le glucose est perfusé à un rythme variable pour maintenir un taux de glucose sanguin spécifique. Si la souris ne peut pas se remettre de l’hypoglycémie, plus de glucose doit être perfusé.
Bien qu’il y ait de nombreux avantages à effectuer des pinces hyperglycémiques et hypoglycémiques, les procédures chirurgicales et expérimentales sont considérées comme techniquement difficiles. Ainsi, peu de groupes de recherche ont pu les faire. Nous avons cherché à décrire ces méthodes pour les chercheurs ayant des contraintes financières et de main-d’œuvre afin de démarrer ces expériences avec un budget inférieur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co. KGaA</td>
			<td>LOCTITE 454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA kit (C-peptide)</td>
			<td>Morinaga Institute of Bilogical Science Inc</td>
			<td>M1304</td>
			<td>Mouse C-peptide ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA kit (insulin)</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>633-03411</td>
			<td>LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handy glucose meter</td>
			<td>Nipro Co.</td>
			<td>11-777</td>
			<td>Free Style Freedom Lite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (100U/ml)</td>
			<td>Eli Lilly &#38; Co.</td>
			<td>428021014</td>
			<td>Humulin R (100U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse</td>
			<td>Japan SLC Inc.</td>
			<td>C57BL/6NCrSlc</td>
			<td>C57BL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Natsume seisakusho</td>
			<td>C-23S-560 No.2</td>
			<td>Sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Pump Systems Inc.</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic suture</td>
			<td>V&#214;MEL</td>
			<td>HR-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing1</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>9-869-01</td>
			<td>LABORAN(R) Silicone Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427400</td>
			<td>BD Intramedic PE Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing3</td>
			<td>IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.</td>
			<td>size5</td>
			<td>Polyethylene tubing size5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hyperglycemic clamp and hypoglycemic clamp in conscious mice

Le diabète sucré (DS) est causé par une libération insuffisante d’insuline par les cellules β pancréatiques (diabète de type 1) et une sensibilité à l’insuline dans les muscles, le foie et les tissus adipeux (diabète de type 2). L’injection d’insuline traite les patients atteints de diabète sucré mais entraîne une hypoglycémie comme effet secondaire. Le cortisol et les catécholamines sont libérés pour activer la production de glucose du foie afin de récupérer l’hypoglycémie, appelée réponse contre-régulatrice (CRR). Dans la recherche sur le diabète à l’aide de modèles de rongeurs, des tests de tolérance au glucose et l’injection de 2-désoxyglucose sont utilisés pour mesurer la libération d’insuline et la CRR, respectivement. Cependant, les concentrations de glucose dans le sang changent constamment au cours des expériences, ce qui rend difficile l’évaluation de la libération nette d’insuline et de la CRR. Cet article décrit une méthode dans laquelle la glycémie est maintenue à 250 mg/dL ou 50 mg/dL chez des souris conscientes pour comparer la libération d’insuline et d’hormones CRR, respectivement.
Un tube en polyéthylène est implanté dans l’artère carotide et la veine jugulaire des souris, et les souris sont autorisées à se remettre de la chirurgie. Le tube de la veine jugulaire est relié à une seringue Hamilton avec un pousse-seringue pour permettre la perfusion d’insuline ou de glucose à un débit constant et variable. Le tube de l’artère carotide sert à la collecte de sang. Pour le clamp hyperglycémique, 30 % de glucose est perfusé dans la veine et la glycémie est mesurée à partir du sang artériel toutes les 5 ou 10 minutes. Le débit de perfusion de 30 % de glucose est augmenté jusqu’à ce que la glycémie atteigne 250 mg/dL. Le sang est prélevé pour mesurer les concentrations d’insuline. Pour le clamp hypoglycémiant, 10 mU/kg/min d’insuline sont perfusés avec 30% de glucose, dont le débit de perfusion est variable pour maintenir 50 mg/dL de glycémie. Le sang est prélevé pour mesurer les hormones contre-régulatrices lorsque la perfusion de glucose et la glycémie atteignent un état d’équilibre. Les pinces hyperglycémiques et hypoglycémiques ont la même procédure chirurgicale et les mêmes configurations expérimentales. Ainsi, cette méthode est utile pour les chercheurs sur le métabolisme systémique du glucose.

Glucose is an important source of energy for cells, and a lack of glucose can lead to a variety of symptoms and complications. In the event of low glucose (hypoglycemia, generally less than 70 mg/dL in fasting blood glucose level, but should not be determined by a single value1), the most common symptoms include weakness, confusion, sweating, and headache. It can also disrupt cerebral function and increase the risk of cardiovascular events and mortality2. Conversely, hyperglycemia is a medical condition in which the plasma glucose concentration exceeds normal levels (generally &#62; 126 mg/dL in fasting blood glucose level3). This can occur in individuals with diabetes who have either a deficit in insulin production or utilization. Hyperglycemia can lead to diabetic ketoacidosis, which occurs when the body cannot use glucose for energy but instead breaks down fatty acids for fuel. The hyperglycemic hyperosmolar state also increases mortality4. Long-term hyperglycemia can cause damage to blood vessels, nerves, and organs, leading to the development of several chronic complications such as cardiovascular disease, retinopathies, and kidney diseases. Thus, the blood glucose concentration must be maintained in a tight range between 100 mg/dL and 120 mg/dL.
Blood glucose is regulated by the balance between glucose input and output in a one-compartment model (Figure 1A). Glucose input includes absorbed glucose from food and glucose production from the liver, kidneys, and small intestine. Glucose output comprises glucose uptake in tissues and glucose disposal from the kidneys. Both the amount of glucose input and output are regulated by endocrine hormones. For example, glucagon, corticosterone, and catecholamines, known as counter-regulatory hormones, are released when blood glucose levels decrease5. They stimulate the breakdown of glycogen and the synthesis of glucose, mainly from the liver; these processes are known as glycogenolysis and gluconeogenesis, respectively. Hyperglycemia increases insulin release from pancreatic &#946;-cells and stimulates glucose uptake in the muscles, adipose tissues, and heart6,7,8,9. Exercise increases insulin-independent glucose uptake10. The sympathetic nervous system increases glucose uptake in muscles and brown adipose tissue6,11. To measure the ability to regulate glucose metabolism in peripheral tissues, researchers typically use the glucose tolerance test (GTT) and the insulin tolerance test (ITT) (Figure 1B,C). In GTT, two factors must be considered: insulin release and insulin sensitivity (Figure 1B). However, the glucose concentration curve during the 120 min test is different in each mouse, which may affect different amounts of hormone release. In ITT, blood glucose is regulated by both insulin sensitivity and the release of counter-regulatory hormones. Therefore, it is difficult to determine the precise meaning of glucose metabolism, insulin release, and insulin sensitivity in GTT and ITT, in situations where blood glucose levels are not constant.
To overcome these problems, it is desirable to keep blood glucose at a constant level (or &#34;clamp&#34;). In hyperglycemic clamp, glucose is infused into the bloodstream to raise blood glucose levels to a specific level and then maintained at that level for a period of time. The amount of infused glucose is adjusted based on measurements of blood glucose levels every 5-10 min to maintain a steady state. This technique is particularly useful for understanding the parameters of insulin secretion at a clamped glucose level. Hypoglycemic clamp is a method to maintain low blood glucose levels by infusing insulin. Glucose is infused at a variable rate to maintain a specific blood glucose level. If the mouse cannot recover from hypoglycemia, more glucose should be infused.
Although there are many advantages to performing hyperglycemic and hypoglycemic clamps, the surgical and experimental procedures are considered technically difficult. Thus, few research groups have been able to do them. We aimed to describe these methods for researchers with financial and workforce constraints to start these experiments at a lower budget.

Pleins feux sur l’auteur : Étude de l’homéostasie de la glycémie dans le cerveau murin à l’aide d’une technique de clamp hyperglycémique et hypoglycémique rentable

Pince hyperglycémique et pince hypoglycémique chez la souris consciente

Our research investigates how our brain regulates the homeo status of blood glucose levels, and what kind of neurons, neuropeptides, and neuron circuits do that. Additionally, how does our memory of food, psychological stress, pain, and other somatic sensations affect it? It is difficult to assess glucose metabolism precisely.We must check in insulin sensitivity or resistance, insulin secretion and counter regulatory responses. We should also check which tissue changes glucose uptake and glucose production regarding insulin sensitivity or resistance. We believe that not only insulin sensitivity, but also insulin secretion and counter regulatory responses are all affecting normal blood glucose levels, even in healthy conditions.We are trying to understand the whole picture of glucose regulation by the brain. Our protocol is low cost and does not need a special and expensive device to create a clamp. It'll enable researchers to implement the use of the clamp easily and quickly.Because this protocol helps researchers to use the clamp very easily, we expect our protocol will encourage more research in the entire field of life sciences.

L’étude sur l’hypoglycémie clamp a été réalisée chez des souris C57BL/6N mâles (âgées de 8 semaines, plus de 25 g p.c.) à jeun 3 h au début de l’expérience (figure 4A, B). La glycémie initiale était de 136 mg/dL (t = -15 min). S’il est inférieur à 90 mg/dL, cela peut être dû au fait que la chirurgie ne s’est pas bien déroulée, ou que le cathéter artériel a été inséré trop profondément, ou que des caillots sanguins ont pénétré dans le f...

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Une pince hyperglycémique est utilisée pour mesurer la libération d’insuline avec une concentration de glucose sanguin plus élevée. Un clamp hypoglycémique sert à mesurer la production de glucose induite par des réponses contre-régulatrices. Les deux méthodes utilisent la même procédure chirurgicale. Ici, nous présentons une technique de clamp pour évaluer le métabolisme systémique du glucose.

Diabetes mellitus (DM) is caused by insufficient insulin release from the pancreatic &#946;-cells (Type1 DM) and insulin sensitivity in muscles, liver, ...

Nos recherches étudient comment notre cerveau régule l’état homéologique de la glycémie et quels types de neurones, de neuropeptides et de circuits neuronaux le font. De plus, comment notre mémoire de la nourriture, du stress psychologique, de la douleur et d’autres sensations somatiques l’affecte-t-elle ? Il est difficile d’évaluer précisément le métabolisme du glucose.Nous devons vérifier la sensibilité ou la résistance à l’insuline, la sécrétion d’insuline et les réponses contre-régulatrices. Nous devons également vérifier quels tissus modifient l’absorption et la production de glucose en fonction de la sensibilité ou de la résistance à l’insuline. Nous pensons que non seulement la sensibilité à l’insuline, mais aussi la sécrétion d’insuline et les réponses contre-régulatrices affectent toutes les niveaux normaux de glucose dans le sang, même dans des conditions saines.Nous essayons de comprendre l’ensemble de la régulation du glucose par le cerveau. Notre protocole est peu coûteux et ne nécessite pas d’appareil spécial et coûteux pour créer une pince. Cela permettra aux chercheurs de mettre en œuvre l’utilisation de la pince facilement et rapidement.Parce que ce protocole aide les chercheurs à utiliser la pince très facilement, nous espérons que notre protocole encouragera davantage de recherche dans l’ensemble du domaine des sciences de la vie.

hyperglycemic-clamp-and-hypoglycemic-clamp-in-conscious-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Hyperglycemic Clamp and Hypoglycemic Clamp in Conscious Mice

846 vues.  Kumamoto University. Nos recherches étudient comment notre cerveau régule l’état homéologique de la glycémie et quels types de neurones, de neuropeptides et de circuits neuronaux le font. De plus, comment notre mémoire de la nourriture, du stress psychologique, de la douleur et d’autres sensations somatiques l’affecte-t-elle ? Il est difficile d’évaluer précisément le métabolisme du glucose.Nous devons vérifier la sensibilité ou la résistance à l’insuline, la sécrétion d’insulin...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Étude de l’homéostasie de la glycémie dans le cerveau murin à l’aide d’une technique de clamp hyperglycémique et hypoglycémique rentable

Diabetes mellitus (DM) is caused by insufficient insulin release from the pancreatic &#946;-cells (Type1 DM) and insulin sensitivity in muscles, liver, and adipose tissues (Type2 DM). Insulin injection treats DM patients but leads to hypoglycemia as a side effect. Cortisol and catecholamines are released to activate glucose production from the liver to recover hypoglycemia, called counter-regulatory responses (CRR). In DM research using rodent models, glucose tolerance tests and 2-deoxy-glucose injection are used to measure insulin release and CRR, respectively. However, blood glucose concentrations change persistently during experiments, causing difficulties in assessing net insulin release and CRR. This article describes a method in which blood glucose is kept at 250 mg/dL or 50 mg/dL in conscious mice to compare the release of insulin and CRR hormones, respectively.
Polyethylene tubing is implanted in the mice's carotid artery and jugular vein, and the mice are allowed to recover from the surgery. The jugular vein tubing is connected to a Hamilton syringe with a syringe pump to enable insulin or glucose infusion at a constant and variable rate. The carotid artery tubing is for blood collection. For the hyperglycemic clamp, 30% glucose is infused into the vein, and blood glucose levels are measured from the arterial blood every 5 min or 10 min. The infusion rate of 30% glucose is increased until the blood glucose level becomes 250 mg/dL. Blood is collected to measure insulin concentrations. For hypoglycemic clamp, 10 mU/kg/min insulin is infused together with 30% glucose, whose infusion rate is variable to maintain 50 mg/dL of blood glucose level. Blood is collected to measure counter-regulatory hormones when both glucose infusion and blood glucose reach a steady state. Both hyperglycemic and hypoglycemic clamps have the same surgical procedure and experimental setups. Thus, this method is useful for researchers of systemic glucose metabolism.

A hyperglycemic clamp is used for measuring insulin release with a maintained higher blood glucose concentration. A hypoglycemic clamp is for measuring glucose production induced by counter-regulatory responses. Both methods use the same surgical procedure. Here, we present a clamp technique to assess systemic glucose metabolism.

Recherche

Médecine

Surgery to Implant Hypoglycemic and Hyperglycemic Clamp Tubings in Mouse

Chirurgie pour implanter des tubes de clamp hypoglycémiques et hyperglycémiques chez la souris

Setup and Operation of the Hyperglycemic and Hypoglycemic Clamps in Mouse for Monitoring Blood Glucose and Insulin Release

Installation et fonctionnement des pinces hyperglycémiques et hypoglycémiques chez la souris pour la surveillance de la glycémie et de la libération d’insuline